Die On-Target Rate (Zielerreichungsrate) kann wertvolle Informationen über die Spezifität der Zielanreicherung geben. Normalerweise wird diese Rate als Verhältnis der Anzahl sequenzierter Basen, die die Zielregion abdecken und der gesamten Anzahl an Basen, die gemapped wurden, berechnet. Neben der Berechnung des Prozentsatzes der Basen auf der Zielregion, welche auch bekannt sind als On-Target Basen, kann auch der Prozentsatz der Reads auf der Zielregion berechnet werden, welche auch bekannt sind als On-Target Reads. Die Rate der On-Target Reads beinhaltet alle sequenzierten Reads, die an die Zielregion mappen, auch wenn es nur eine einzige Base ist. Je mehr Basen oder Reads an die Zielregion mappen, desto höher ist die On-Target Rate (siehe Abbildung 1). Es wird oft angenommen, dass niedrige On-Target Raten durch verbesserungsfähiges Sonden-Design, minderwertige Substanzen oder Probleme während der Vorbereitungsschritte, wie der Vorbereitung der Library oder der Erfassung der Hybride, zustande kommen.
Abbildung 1 | Erklärung der verschiedenen On-Target Raten. In unserem Beispiel wurden 40 Reads sequenziert. Von diesen 40 Reads mappen 31 Reads (teilweise) auf die Zielregion (rot). Nicht alle Basen eines Reads müssen an die Zielregion mappen, um ein Read zu einem On-Target Read zu machen – bereits eine gemappte Base eines Reads reicht, damit der Read zu einem On-Target Read wird. Im Beispiel beträgt die On-Target Rate für Reads 31/40 ≈ 77.5%. Die hellrote Box hebt die Basen hervor, die auf die Zielregion mappen, wodurch sie zu On-Target Basen werden.
Während der Zielanreicherung werden Fragmente durch Sonden, die komplementär zur Zielregion sind, erfasst. Die Abdeckung der Zielregion nimmt generell zu den Rändern hin ab im Vergleich zur Mitte der Zielregion. Die Anreicherungssonden werden daher bei uns so entworfen, dass sie die Zielgrenzen (z.B. des Exons) so abdecken, dass eine ausreichende Abdeckung der Ränder der Zielregion gewährleistet ist. Dies erhöht die Abdeckung der Ränder auf Kosten einer niedrigeren On-Target Rate, da die erfassten Fragmente nur noch teilweise mit der Zielregionen überlappen. Es kann also irreführend sein, wenn man die On-Target Rate als Qualitätsparameter in zielorientierten Sequenzierexperimenten nutzt. Wenn man die Abdeckung über die Ränder des Exons hinaus in die angrenzenden Regionen erweitert, dann können diese Regionen in den anschließenden Analysen mit betrachtet werden. Unsere langjährige Erfahrung in der Genetik und Sequenzierung zeigt uns, dass relevante Informationen in diesen angrenzenden Regionen zu finden sind. Daher möchten wir nicht die On-Target Rate optimieren, wenn dies gleichzeitig bedeutet, dass die Regionen, die an die Exons angrenzen, nicht mehr analysiert werden können.
CeGaTs On-Target Rate ist unter Umständen geringer als die der Mitbewerber. Allerdings liefern wir dafür weitere Details aus den relevanten Regionen, die an die Zielregionen angrenzen.