Methylation Sequencing

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Höchste Genauigkeit bei allen Prozessen

Der genetische Code setzt sich aus den vier Basen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und Cytosin (C) zusammen. Die Sequenz wird durch Whole Genome Sequencing bestimmt. Whole Genome Sequencing kann Aufschluss über Variationen im genetischen Code geben, darunter Einzelnukleotid-Varianten (Single Nucleotid Variants, SNVs), kleine Insertionen und Deletionen (InDels), Kopienzahlveränderungen (Copy Number Variations, CNVs) und Strukturvarianten (Structural Variants, SVs). Diese Varianten können bei Krankheiten eine entscheidende Rolle spielen. Daher kann Whole Genome Sequencing u. a. zur Erforschung von Krankheiten, zu Krebsstudien, zu Methoden der personalisierten Medizin sowie zur translationalen Medizin beitragen.

Whole Genome Sequencing erfasst jedoch nicht das Epigenom einer Zelle. In der Epigenomforschung werden die Veränderungen in der Genfunktion untersucht, die nicht auf Veränderungen in der Genomsequenz zurückzuführen sind, z. B. durch Mutationen oder Rekombination. Diese epigenetischen Veränderungen in der Genfunktion werden an die Tochterzellen weitergegeben. Dies geschieht z. B. durch Methylierung von Cytosinen. Besonders Cytosine, auf die Guanine folgen, so genannte CpG-Regionen, werden modifiziert. Wird die fünfte Kohlenstoffposition mit einer Methylgruppe modifiziert, entsteht ein 5- Methylcytosin (5mC). Die Oxidation dieses 5mC führt zur Bildung von 5- Hydroxymethylcytosin (5hmC). Diese DNA-Methylierung kann mit einer veränderten Genexpression verbunden sein. Methylierte Cytosine finden sich beispielsweise an Transkriptionsstartstellen von reprimierten Genen. Die Methylierung kann aber auch mit der Aktivierung von Genen verbunden sein, z. B. während der Entwicklung. Daher kann die Aufdeckung des Methylierungsmusters einer Zelle von entscheidender Bedeutung für das Verständnis biologischer Prozesse, z. B. des Alterns, aber auch für die Diagnose von Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Nervenstörungen sein.

Da die Veränderungen im Methylierungsmuster von der Whole Genome Sequencing nicht erfasst werden, wurde Methylation Sequencing entwickelt. Bis vor kurzem wurde Methylation Sequencing mittels Bisulfit-Sequenzierung durchgeführt. Dabei wird Natriumbisulfit verwendet, um unmethylierte Cytosine chemisch zu modifizieren. Diese Modifikation führt zu einer Desaminierung von Cytosinen zu Uracil. Da 5mc und 5hmc methyliert sind, werden sie nicht in Uracil umgewandelt und können als methylierte Cytosine nachgewiesen werden. Die Bisulfit-Sequenzierung hat jedoch den Nachteil der DNA-Schädigung. Während des Prozesses können extreme Temperaturen und pH-Werte zu einem Abbau der DNA führen. Dieser Abbau ist zudem nicht gleichmäßig über das Genom verteilt, was zu fehlerhaften Sequenzierungsdaten führt.

Aus diesem Grund wurde die enzymatische Methyl-Sequenzierung (EM-Seq) als neue Methode zur Bestimmung der Methylierung des Genoms entwickelt. In zwei enzymatischen Reaktionen werden 5mC und 5hmC nachgewiesen. Zunächst wandeln die beiden Enzyme Tet-Methylcytosin-Dioxygenase 2 (TET2) und T4- Phage-β-Glucosyltransferase (T4-BGT) die methylierten Cytosine in nicht deaminierbare Produkte um. Anschließend desaminiert das Apolipoprotein B mRNA-Editierungsenzym katalytische Untereinheit 3A (APOBEC3A) alle nicht modifizierten Cytosine. Mit diesen drei Enzymen können methylierte Cytosine identifiziert werden.

Die enzymatische Methyl-Sequenzierung hat im Vergleich zur Bisulfit-Sequenzierung mehrere Vorteile:

• Da die enzymatische Konversion sanfter ist als die Bisulfit-Konversion, kommt es bei der enzymatischen Methyl-Sequenzierung zu weniger DNA-Schäden. Daraus resultieren Sequenzier-Librarys mit längeren Inserts, die das Mapping der Reads erleichtert.
• Zusätzlich zu den längeren Inserts ermöglicht die sanftere Enzym Methyl-Sequenzierung auch eine höhere Qualität der Librarys, die effizienter amplifiziert werden können. Das Ergebnis ist eine höhere Ausbeute mit weniger PCR-Zyklen. Zudem weist die Enzym Methyl-Sequenzierung konstant eine niedrigere Anzahl an Dublikaten auf, unabhängig von der Menge des Eingangsmaterials.
• Bei der Bisulfit-Sequenzierung sind besonders CpG-Regionen von der unsanften Konvertierung betroffen. In diesen CpG-Regionen treten mehr Schäden, Brüche und Verluste auf, was zu einer Unterrepräsentation dieser Regionen bei der Bisulfit-Sequenzierung führt. Diese Verzerrung ist bei der enzymatische Methyl-Sequenzierung nicht zu beobachten: EM-Seq-Librarys zeigen eine gleichmäßige GC-Abdeckung.

Die Enzym-Methyl-Sequenzierung ist eine schonende und unkomplizierte Methode zur Analyse der Methylierungsmuster in einem Genom. EM-Seq eröffnet neue Möglichkeiten für Forschung und klinische Anwendungen und verbessert das Verständnis der Epigenetik im Hinblick auf Gesundheit und Krankheit.

Tech Note (EN)