Die DNA-Methylierung ist eine der häufigsten epigenetischen Veränderungen, die die Genexpression, die zelluläre Differenzierung und die genomische Prägung (Imprinting) grundlegend beeinflussen. Ohne die DNA-Sequenz selbst zu verändern, kann die Genaktivität und Genfunktion durch DNA-Methylierung reguliert werden. DNA-Methyltransferasen übertragen eine Methylgruppe an das fünfte Kohlenstoffatom des Cytosinrings und beeinflussen so die Regulation der Genaktivität und Genfunktion. Bei Säugetieren kommen die daraus resultierenden 5‑Methylcytosine (5-mC) und 5‑Hydroxymethylcytosine (5-hmC) hauptsächlich in Cytosin-Phosphat-Guanin (CpG)-Dinukleotiden vor. In anderen Organismen findet sich die Methylierung aber auch bei Nicht-CpG-Dinukleotiden (CpA-, CpT- und CpC-Dinukleotide).
Bei der normalen Zellentwicklung und Zellalterung sind Veränderungen in der epigenetischen Signatur, insbesondere in der DNA-Methylierung, zu beobachten. Allerdings sind diese Veränderungen auch assoziiert mit der Entstehung von Krankheiten wie Krebs, Stoffwechselstörungen und neurologischen Erkrankungen. Beispielsweise erhöhen so genannte globale Hypomethylierungen und ortsspezifische Hypermethylierungen von CpG-Inseln die genomische Instabilität und fördern das Fortschreiten von Tumoren.
Die Analyse qualitativ hochwertiger Methylierungsdaten kann für folgende Forschungsziele oder Fragestellungen nützlich sein:
- Entdeckung von Biomarkern
- klinische Studien mit epigenetischen Therapien oder andere klinische und wissenschaftliche Anwendungen
- Erforschung von Zelldifferenzierungsmechanismen, charakteristischen Methylierungsprofilen und spezifischer Gewebeentwicklung
Wir bieten verschiedene Whole-Genome-Methylation-Sequencing (WGM)-Produkte an, um Ihr Forschungsprojekt zu realisieren.
CeGaT ist der beste Partner für Ihr Sequenzierprojekt
Unser Engagement für Sie
Schnelle Bearbeitung
Bearbeitungszeit
≤ 15 Werktage
Hohe Qualität
Höchste Genauigkeit bei allen Prozessen
Sichere Datenlieferung
Sichere Bereitstellung der sequenzierten Daten über hausinterne Server
Sichere Aufbewahrung
Sichere Proben- und Datenaufbewahrung nach Projektabschluss
Unser Service
Uns ist eine umfangreiche und erstklassige Projektbegleitung wichtig − von der Auswahl des passenden Produktes bis zur Auswertung der Daten. Jedes Projekt wird von einer engagierten Wissenschaftlerin oder einem engagierten Wissenschaftler begleitet, so dass Ihnen während des gesamten Projektverlaufs eine Ansprechpartnerin oder ein Ansprechpartner zur Seite steht.
Unser Service umfasst:
- Ausführliche Projektberatung
- Produktauswahl abgestimmt auf Ihr Projekt
- Umfangreiche bioinformatische Auswertung Ihrer Daten
- Abschließender und detaillierter Projektbericht mit Informationen zur Probenqualität, Sequenzierparametern, bioinformatischen Analysen und Ergebnissen
Profitieren Sie von unserem hervorragenden Support und unseren akkreditierten Arbeitsabläufen.
Unser Produktportfolio für Methylation Sequencing
Wir bieten verschiedene Whole-Genome-Methylation-Sequencing (WGM)-Produkte für eine Vielzahl von Forschungsfragen an. Wünschen Sie zusätzlich zu den beinhalteten Leistungen bioinformatische Analysen Ihrer Daten? Jedes unserer Produkte kann durch weitere Dienstleistungen ergänzt werden. Wir beraten Sie gerne.
WGM Classic | WGM Flex | HiFi WGM |
Spezies | Spezies | Spezies |
DNA-Qualität | DNA-Qualität | DNA-Qualität |
Detektionsmethode | Detektionsmethode | Detektionsmethode |
Sequenzierplattform | Sequenzierplattform | Sequenzierplattform |
Output | Output | Output |
Beinhaltete Leistungen | Beinhaltete Leistungen | Beinhaltete Leistungen |
Bioinformatik
Für WGM Classic und WGM Flex werden die Rohdaten der Sequenzierung automatisch verarbeitet. Wir bieten verschiedene Level bioinformatischer Analysen an. Das Standardlevel ist Level 1. Mit steigendem Bioinformatiklevel werden mehr Daten geliefert. Alle höheren Level beinhalten dabei die Daten der vorherigen Level. Zusätzlich zu den Daten und unabhängig vom Analyselevel wird ein Projektbericht verfasst.
Für unser HiFi-WGM-Produkt bieten wir ein Level bioinformatischer Analysen an. Dieses beinhaltet:
Level 1:
- Demultiplexing und Adapter-Trimming der Sequenzierdaten (FASTQ-Datei)
Level 2:
- Mapping der Sequenzierdaten (BAM-Datei)
- Konvertierungsrate (Analyse der positiven (pUC19) und negativen Kontrolle (Lambda-Phagen) für jede Probe) (TSV-Datei)
- Bestimmung der Methylierung, einschließlich:
- M-Bias-Bericht (TXT-Datei)
- Cytosin-Bericht (TXT-Datei)
- Metriken zur Methylierung (TSV- und PDF-Datei)
- Metriken zur Coverage (TSV- und PDF-Datei)
Level 1:
- Demultiplexing und Clipping der Sequenzierdaten (geklippte BAM- Datei)
- Geklippte Sequenzierdaten im FASTQ-Format
- Mapping der Sequenzierdaten (BAM- und PBI-Datei)
- Bestimmung der Methylierung (BED- und BIGWIG-Datei)
Technische Information
CeGaTs WGM-Classic- und WGM-Flex-Produkte bieten den genomweiten Nachweis von Methylierungsmustern auch in Regionen mit geringer Cytosin-Phosphat-Guanin (CpG)-Dichte. Während der Herstellung der Sequenzier-Library werden unmethylierte Cytosine in Uracil umgewandelt und können so von methylierten und hydroxymethylierten Cytosinen unterschieden werden. Für die Konvertierung verwenden wir die enzymbasierte Methode (enzymatic Methyl-Seq, EM-seq™). Im Vergleich zur konventionellen Bisulfit-Konvertierung, die traditionell für Whole Genome Bisulfit Sequencing (WGBS) eingesetzt wird, verursacht die sanftere, enzymatische Konvertierung deutlich weniger DNA-Schäden, was zu einer äußerst genauen Detektion der Methylierungsmuster führt. Weitere Details finden Sie in unserer Tech Note. Für WGM Classic und WGM Flex wird die Paired-End-Sequenzierung (2 x 150 bp) mit den Sequenzierplattformen von Illumina durchgeführt.
Bei unserem HiFi-WGM-Produkt nutzen wir die Long-Read-Sequenziertechnologie von PacBio, um epigenetische Veränderungen zu erkennen, ohne die DNA-Basen zu verändern oder zu konvertieren. Daher sind keine Änderung an der Vorbereitung der Library oder dem Sequenzierablauf notwendig. Während des Sequenzierprozesses werden die methylierten Cytosine im CpG-Kontext mit Hilfe der Einbaukinetik der Basen erkannt. Unsere PacBio-Sequenzierplattform ermöglicht uns die Sequenzierung von Fragmenten mit einer Länge von bis zu 18 kb.
Wenn Sie andere Sequenzierparameter benötigen, lassen Sie es uns gerne wissen! Wir können Ihnen weitere Lösungen anbieten.
Weitere Informationen zu Methylation Sequencing
Der genetische Code setzt sich aus den vier Basen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und Cytosin (C) zusammen. Die Sequenz wird durch die vollständige Genomsequenzierung, auch bekannt als Whole Genome Sequencing, bestimmt. Whole Genome Sequencing kann Aufschluss über Variationen im genetischen Code geben. Zu diesen Variationen gehören Einzelnukleotid-Varianten („single nucleotid variants“, SNVs), kleine Insertionen und Deletionen (kurz Indels), Kopienzahlveränderungen („copy number variations“, CNVs) und Strukturvarianten („structural variants“, SVs). Diese Varianten können bei Krankheiten eine entscheidende Rolle spielen. Daher kann Whole Genome Sequencing unter anderem zu Krebsstudien, Methoden der personalisierten Medizin, translationalen Medizin oder zur Erforschung von Krankheiten beitragen.
Whole Genome Sequencing erfasst jedoch nicht das Epigenom einer Zelle. Bei der Erforschung des Epigenoms werden die Veränderungen der Genfunktion untersucht, die nicht auf Änderungen in der Genomsequenz, z. B. durch Mutationen oder Rekombinationen, zurückzuführen sind. Die epigenetischen Veränderungen der Genfunktion werden an die Tochterzellen weitergegeben. Dies geschieht z. B. durch Methylierung von Cytosinen. Besonders Cytosinbasen, auf die Guaninbasen folgen, so genannte CpG-Regionen, werden modifiziert. Wird die fünfte Kohlenstoffposition mit einer Methylgruppe modifiziert, entsteht ein 5-Methylcytosin (5mC). Die Oxidation dieses 5mC führt zur Bildung von 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC). Diese DNA-Methylierung kann mit einer veränderten Genexpression verbunden sein. Methylierte Cytosine finden sich beispielsweise an Transkriptionsstartstellen von herunterregulierten Genen. Allerdings kann die Methylierung auch mit der Aktivierung von Genen verbunden sein, z. B. während der Entwicklung. Daher kann die Untersuchung des Methylierungsmusters einer Zelle von entscheidender Bedeutung für das Verständnis biologischer Prozesse sein: Nicht nur Alterungsprozesse können besser verstanden, sondern auch Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Nervenstörungen können besser diagnostiziert werden.
Um die Veränderungen im Methylierungsmuster zu erfassen, wurde das so genannte Methylation Sequencing entwickelt. Bis vor kurzem wurde Methylation Sequencing mittels Bisulfit-Sequenzierung durchgeführt. Dabei wird Natriumbisulfit verwendet, um unmethylierte Cytosine chemisch zu modifizieren. Diese Modifikation führt zu einer Desaminierung von Cytosin zu Uracil. Da 5mc und 5hmc methyliert sind, können sie nicht durch die Desaminierung in Uracil umgewandelt und somit als methylierte Cytosine nachgewiesen werden.
Der Nachteil der Bisulfit-Sequenzierung ist jedoch die einhergehende DNA-Schädigung. Während des Desaminierung-Prozesses können extreme Temperaturen und pH-Werte zu einem Abbau der DNA führen. Dieser Abbau ist nicht gleichmäßig über das Genom verteilt, was zu fehlerhaften Sequenzierungsdaten führt.
Aus diesem Grund wurde die enzymatische Methyl-Sequenzierung (EM-Seq) als eine neue Methode zur Bestimmung der Methylierung des Genoms entwickelt. In zwei enzymatischen Reaktionen werden 5mC und 5hmC nachgewiesen. Zunächst wandeln die beiden Enzyme Tet-Methylcytosin-Dioxygenase 2 (TET2) und T4-Phage-β-Glucosyltransferase (T4-BGT) die methylierten Cytosinbasen in nicht deaminierbare Produkte um. Anschließend desaminiert das Apolipoprotein B mRNA-Editierungsenzym katalytische Untereinheit 3A (APOBEC3A) alle nicht modifizierten Cytosinbasen. Mit diesen drei Enzymen können methylierte Cytosinbasen identifiziert werden.
Die enzymatische Methyl-Sequenzierung hat im Vergleich zur Bisulfit-Sequenzierung mehrere Vorteile:
- Da die enzymatische Umwandlung schonender ist als die Bisulfit-Umwandlung, kommt es bei der enzymatischen Methyl-Sequenzierung zu weniger DNA-Schäden. Daraus resultieren Sequenzier-Librarys mit längeren Inserts, die das Mapping der Reads erleichtern.
- Zusätzlich zu den längeren Inserts ermöglicht die schonendere enzymatische Methyl-Sequenzierung auch eine höhere Qualität der Librarys, die effizienter amplifiziert werden können. Das Ergebnis ist eine höhere Ausbeute mit weniger PCR-Zyklen. Zudem weist die enzymatische Methyl-Sequenzierung unabhängig von der Menge des Eingangsmaterials eine niedrigere Anzahl an Duplikaten auf.
- Bei der Bisulfit-Sequenzierung sind besonders CpG-Regionen von der schädigenden Umwandlung betroffen. In diesen CpG-Regionen treten mehr Schäden, Brüche und Verluste auf, was zu einer Unterrepräsentation dieser Regionen bei der Bisulfit-Sequenzierung führt. Diese Verzerrung ist bei der enzymatische Methyl-Sequenzierung nicht zu beobachten: EM-Seq-Librarys zeigen eine gleichmäßige GC-Abdeckung.
Die enzymatische Methyl-Sequenzierung ist eine schonende und unkomplizierte Methode zur Analyse der Methylierungsmuster in einem Genom. EM-Seq eröffnet neue Möglichkeiten für Forschung und klinische Anwendungen und verbessert das Verständnis der Epigenetik im Hinblick auf Gesundheit und Krankheit.
Mit PacBio’s long-read HiFi-Sequenzierung bietet CeGaT eine weitere Option für die Bestimmung des Methylierungsstatus Ihrer Probe an. Im Gegensatz zur Bisulfit-Sequenzierung des gesamten Genoms oder der enzymatischen Methyl-Sequenzierung ist bei diesem Ansatz keine DNA-Modifizierung oder Konvertierung der Nukleotide notwendig, um die Methylierung von 5-Methylcytosinen (5mC) in CpG-Regionen zu bestimmen. Während der Sequenzierung wird das Fluoreszenz-Signal erfasst, um das eingebaute Nukleotid genau zu identifizieren. Zusätzlich wird aber auch die Kinetik der Polymerase gemessen. Die Kinetik des Nukleotid-Einbaus wird durch die Umgebung der Base und epigenetischen Veränderungen beeinflusst. Daher kann das Erfassen der Kinetik wertvolle Informationen über den Methylierungsstatus liefern, ohne dass hierfür die Basen vor der Sequenzierung verändert werden müssen. Die gemessene Kinetik wird in einem künstlichen neuronalen Netz („convolutional neural network“) weiterverarbeitet, um den Methylierungsstatus jeder CpG-Region zu bestimmen. Mit diesem neuronalen Netzwerk wird somit die Wahrscheinlichkeit der Methylierung für jede CpG-Region angegeben.
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Bitte geben Sie, falls möglich, folgende Probeninformationen an: Ausgangsmaterial, Anzahl der Proben, bevorzugte Option für die Vorbereitung der Library, bevorzugte Sequenziertiefe und gewünschte bioinformatische Analysestufe.
