Transcriptome Sequencing

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Höchste Genauigkeit bei allen Prozessen

Transcriptome Sequencing wird auch als RNA-Sequenzierung (RNA Seq) bezeichnet. Bei dieser Methode werden die zu einer bestimmten Zeit vorhandenen RNA-Moleküle innerhalb einer Probe analysiert. So wird der Stoffwechselzustand einer Probe dargestellt und spiegelt den biologischen Zustand der Zelle zu diesem Zeitpunkt wider. Transcriptome Sequencing ermöglicht die Identifizierung alternativer Gene, gespleißter Transkripte und posttranskriptioneller Modifikationen. Zusätzlich können Genfusionen und Veränderungen der Genexpression im zeitlichen Verlauf, zum Beispiel während einer Therapie, oder zwischen verschiedenen Gruppen untersucht werden. Mit Transcriptome Sequencing können also Genfunktion und Genstruktur interpretiert werden. Darüber hinaus kann die Funktion von nicht-proteinkodierenden RNAs analysiert werden. Transcriptome Sequencing kann sowohl molekulare Mechanismen von Krankheiten und deren Entstehung als auch spezifische biologische Prozesse aufdecken. Außerdem können seltene oder unbekannte Transkripte sowie variable Spaltstellen („cleavage sites“) und Einzelnukleotid-Polymorphismen der kodierenden Sequenz identifiziert werden.

RNA Seq hat gegenüber anderen Transcriptome-Sequencing-Technologien, wie z. B. Microarrays, einige Vorteile. Die Methode ist hochempfindlich und ermöglicht sowohl Nachweis als auch die Quantifizierung der Transkripte einer Zelle. Außerdem wird bei RNA Seq jedes einzelne Nukleotid eines Transkripts genau bestimmt. Im Unterschied zur Microarray-Technologie gibt es bei RNA Seq zum Beispiel keine Probleme mit Kreuzreaktionen oder Hintergrundrauschen von Fluoreszenzsignalen.

Innerhalb von RNA Seq können verschiedene Vorgehensweisen verwendet werden. Es ist entweder möglich, das gesamte Transkriptom („whole transcriptome sequencing“) oder das kodierende Transkriptom („coding transcriptome sequencing“) zu analysieren. Bei der Sequenzierung des gesamten Transkriptoms werden sowohl kodierende RNAs als auch nicht-kodierende RNAs erfasst. Im Gegensatz dazu zielt die Sequenzierung des kodierenden Transkriptoms auf die mRNA-Moleküle ab, um die Genexpression zu quantifizieren und die differentiellen Genexpression zu analysieren.

Je nach Versuchsaufbau oder Forschungsfrage kann die Gesamt-RNA oder die mRNA sequenziert werden. Die Gesamt-RNA umfasst sowohl die kodierende als auch nicht-kodierende RNA. Wir nennen dieses Produkt WTS, für Whole Transcriptome Sequencing. Die RNA-Isolierung kann aus Zellen, Blut oder sogar aus FFPE-eingebettetem Gewebe erfolgen und entweder von Ihnen oder von CeGaT durchgeführt werden. Die Gesamt-RNA enthält viele verschiedene RNA-Typen, wie z. B. mRNA, ribosomale RNA und nicht-kodierende RNA.

Nach der reversen Transkription, dem Hinzufügen von Adaptern und Barcodes und der PCR-Amplifikation wird die fertige Library auf einem unserer hochmodernen Sequenziergeräte sequenziert. Selbst schwierige Proben, wie z. B. fragmentierte RNA, lassen sich mit unseren Protokollen für Gesamt-RNA gut analysieren. Da die ribosomale RNA mehr als 80 % aller zellulären RNAs ausmacht, empfehlen wir die rRNA-Depletion. Wir können das Transkriptom von Säugetieren, Pflanzen, Viren und Bakterien analysieren und haben viele verschiedene Gesamt-RNA-Protokolle für viele verschiedene Anwendungen entwickelt. Die Transkriptom-Analyse ermöglicht einen umfassenden und genomweiten Überblick über alle Transkripte in einem Organismus sowie eine genomweite Expressionsanalyse. Es können Introns, Exons, aber auch Regionen dazwischen analysiert werden, um Aufschluss über Spleißmechanismen zu erhalten.

Die Sequenzierung der kodierenden RNA ist der gängigste Ansatz für die Transkriptom-Sequenzierung. Hierfür bieten wir das Produkt CTS, für Coding Transcriptome Sequencing, an. Die mRNA macht nur 1-5 % der gesamten RNA aus. Sie hat einen kodierenden Bereich, der am 5′- und 3′-Ende von zwei UTRs, den so genannten untranslatierten Bereichen („untranslated regions“), flankiert wird. Diese tragen eine 5′-Cap-Struktur und eine 3′- Polyadenylierung, den so genannten Poly-A-Schwanz. Dieser Poly-A-Schwanz erhöht die Stabilität und die Translationseffizienz der mRNA. Die meisten Eukaryoten wie Säugetiere, Insekten, Pflanzen, Pilze und Fische tragen diesen Poly-A-Schwanz. In der mRNA von Bakterien ist er jedoch nicht vorhanden. Dieser Poly-A-Schwanz ist für die Herstellung der mRNA-Library unerlässlich. Nach der Isolierung der RNA aus Zellen oder Gewebe muss die mRNA mit Hilfe von Poly-T-Oligos gereinigt werden, die an Magnetkügelchen gekoppelt sind und an den Poly-A-Schwanz binden. Die endgültige Sequenzier-Library wird dann auf einem unserer modernen Sequenziergeräte analysiert.

Wir können das kodierende Transkriptom von Säugetieren, Pflanzen und anderen Eukaryoten analysieren. Die mRNA-Sequenzierung ist sehr empfindlich, vor allem, wenn man mRNA analysieren will, die nur in sehr geringen Mengen exprimiert wird. Eines der Hauptziele der mRNA-Sequenzierung ist die Quantifizierung der Genexpression und die Analyse der differentiellen Genexpression. Sie wird häufig verwendet, um die Genexpression zwischen verschiedenen Gruppen zu vergleichen, insbesondere bei Experimenten zu Arzneimitteltherapien oder medikamentösen Behandlungen von Krankheiten.