Transcriptome Sequencing

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Höchste Genauigkeit bei allen Prozessen

Transcriptome Sequencing wird auch als RNA-Sequenzierung (RNA Seq) bezeichnet. Bei diesem Ansatz werden die vorhandenen RNA-Moleküle innerhalb einer Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt analysiert. So wird der Stoffwechselzustand einer bestimmten Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt dargestellt und spiegelt den biologischen Zustand der Zellen wider. Transcriptome Sequencing ermöglicht die Identifizierung alternativer Gene, gespleißter Transkripte und posttranskriptioneller Modifikationen. Ebenso können Genfusionen und Veränderungen der Genexpression im zeitlichen Verlauf während einer Therapie oder zwischen verschiedenen Gruppen untersucht werden. Mit Transcriptome Sequencing können also Genfunktion und Genstruktur interpretiert werden. Ebenso kann die Funktion von nicht-proteinkodierenden RNAs kann analysiert werden. Transcriptome Sequencing kann molekulare Mechanismen der Krankheitsentstehung und spezifische biologische Prozesse aufdecken. Außerdem können seltene oder unbekannte Transkripte sowie variable Cleavage-Sites und Einzelnukleotid-Polymorphismen der kodierenden Sequenz identifiziert werden.

RNA Seq hat gegenüber anderen Transcriptome-Sequencing-Technologien, wie Microarrays, Vorteile. Die Methode ist hochempfindlich und ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung fast aller Transkripte in einer Zelle. Außerdem wird bei RNA Seq jedes einzelne Nukleotid jedes Transkripts genau bestimmt. Im Unterschied zur Microarray-Technologie, gibt es bei RNA Seq zum Beispiel keine Probleme mit Kreuzreaktionen oder Hintergrundrauschen von Fluoreszenzsignalen.

Innerhalb von RNA Seq können verschiedene Vorgehensweisen verwendet werden. Es ist entweder möglich, das gesamte Transkriptom (Whole Transcriptome Sequencing) oder das kodierende Transkriptom (Coding Transcriptome Sequencing) zu analysieren. Bei Whole Transcriptome Sequencing werden sowohl kodierende RNA als auch viele Arten nicht-kodierender RNAs erfasst. Im Gegensatz dazu zielt Coding Transcriptome Sequencing auf die mRNA-Moleküle ab, um die Genexpression zu quantifizieren und die differentiellen Genexpression zu analysieren.

Je nach Versuchsaufbau oder Forschungsziel kann die Gesamt-RNA oder die mRNA sequenziert werden. Die Gesamt-RNA umfasst sowohl kodierende als auch nicht-kodierende RNA. Wir nennen dieses Produkt WTS, für Whole Transcriptome Sequencing. Die RNA-Isolierung kann aus Zellen, Blut oder sogar aus FFPE-eingebettetem Gewebe erfolgen und entweder von Ihnen oder von CeGaT durchgeführt werden. Die Gesamt-RNA enthält viele verschiedene RNA-Typen, wie z. B. mRNA, ribosomale RNA und nicht-kodierende RNA.

Nach der reversen Transkription, dem Hinzufügen von Adaptern und Barcodes und dem PCR-Amplifikationsschritt wird die fertige Library auf einem unserer hochmodernen Sequenziergeräte sequenziert. Selbst schwierige Proben, wie z. B. fragmentierte RNA, lassen sich mit unseren Protokollen für Gesamt-RNA gut analysieren. Da die ribosomale RNA mehr als 80 % aller zellulären RNAs ausmacht, empfehlen wir die rRNA-Depletion. Wir können das Transkriptom von Säugetieren, Pflanzen, Viren und Bakterien analysieren und haben viele verschiedene Gesamt-RNA-Protokolle für alle Arten von Anwendungen entwickelt. Die Transkriptom-Analyse ermöglicht einen umfassenden und genomweiten Überblick über alle Transkripte in einem Organismus sowie eine genomweite Expressionsanalyse. Es können Introns, Exons, aber auch Regionen dazwischen analysiert werden, um Aufschluss über Spleißmechanismen zu erhalten.

Die Sequenzierung der kodierenden RNA ist der gängigste Ansatz für die Transkriptom-Sequenzierung. Wir nennen dieses Produkt CTS, für Coding Transcriptome Sequencing. Die mRNA hat einen kodierenden Bereich, der am 5′- und 3′-Ende von zwei UTRs, den so genannten untranslatierten Bereichen, flankiert wird. Diese trägt ein 5′-Cap und am 3′-Ende eine Polyadenylierung, den so genannten Poly-A-Schwanz. Dieser Poly-A-Schwanz erhöht die Stabilität und die Translationseffizienz der mRNA. Die meisten Eukaryoten wie Säugetiere, Insekten, Pflanzen, Pilze und Fische tragen diesen Poly-A-Schwanz. In der mRNA von Bakterien ist er jedoch nicht vorhanden. Dieser Poly-A-Schwanz ist für die Herstellung der mRNA-Library unerlässlich. Die mRNA macht nur 1-5 % der gesamten RNA aus. Nach der Isolierung der RNA aus Zellen oder Gewebe muss die mRNA mit Hilfe von Poly-T-Oligos gereinigt werden, die an Magnetkügelchen gekoppelt sind und an den Poly-A-Schwanz binden. Die endgültige Sequenzier-Library wird dann auf einem unserer modernen Sequenziergeräte analysiert.

Wir können das kodierende Transkriptom von Säugetieren, Pflanzen und anderen Eukaryoten analysieren. Die mRNA-Sequenzierung ist sehr empfindlich, vor allem, wenn man mRNA analysieren will, die nur in sehr geringen Mengen exprimiert wird. Das Hauptziel der mRNA-Sequenzierung ist die Quantifizierung der Genexpression und die Analyse der differentiellen Genexpression. Sie wird häufig verwendet, um die Genexpressionsniveaus zwischen verschiedenen Gruppen zu analysieren, insbesondere wenn Sie Experimente zur Behandlung von Medikamenten oder Krankheiten planen.