Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (“Single-Cell RNA Sequencing”) ermöglicht die Erforschung der Transkription auf Einzelzellebene. Neben der Identifikation verschiedener Zelltypen in einer Probe ist es so auch möglich, deren Genexpression zu analysieren. Dies macht Single-Cell RNA Sequenzierung zu einer vielversprechenden Methode, um die zelluläre Heterogenität in freischwimmenden Zellen wie beispielsweise peripheren mononukleären Zellen, aber auch in komplexen Geweben wie der Leber oder dem Darm zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht Single-Cell RNA Sequencing im Rahmen der Tumordiagnostik die Identifikation von Tumorstadien und auch die Charakterisierung der Tumormikroumgebung. Durch diese Informationen können sich Aussagen zur Prognose aber auch zur Therapie treffen lassen.
Die Annotation des jeweiligen Zelltyps erfolgt über die Identifikation zelltyp-spezifischer Markergene, wie zum Beispiel CD3D für T-Zellen bei der Analyse von peripheren mononukleären Zellen aus Blut. Betrachtet man aber komplex aufgebaute Gewebe und Organe wie das Gehirn, wird die Differenzierung unterschiedlicher Zelltypen zur immer größeren Herausforderung, da hier nicht nur die Genexpression, sondern auch die Lokalisation der Zellen im Organ eine Rolle spielen. Hinzu kommt, dass die Erforschung verschiedener Stoffwechsel- und Signalwege aufgrund der fehlenden räumlichen Information limitiert ist und es so nicht möglich ist, Interaktionen zwischen Einzelzellen darzustellen. Besonders zum Tragen kommt dies auch bei der Erforschung der Tumorheterogenität, vor allem in Bezug auf die Verortung immunsuppressiver Immunzellen.
An diesem Punkt setzt Spatial Transcriptomics (Workflow in Abbildung 1) an; durch diese Methode ist es nun auch möglich, die Genexpression im Gewebeverband zu analysieren und so Transkriptionsanalyse und Morphologie zu verbinden.
Ausgangsmaterial hierfür sind gefrorene oder FFPE (Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete) Gewebeproben (1). Diese werden verwendet, um hauchdünne Gewebeschnitte anzufertigen und auf Objektträger aufzubringen (2). Anschließend wird eine klassische histologische Färbemethode oder eine Immunfluoreszenzfärbung verwendet, um die räumliche Gewebemorphologie darzustellen (3).
Für die Transkriptionsanalyse wird im folgenden Schritt die Ziel-RNA der Zellen auf dem Objektträger an Spezies-spezifische Oligonukleotid-Sonden ligiert (ein Satz von Sondenpaaren für jedes Zielgen) (4). Sonden, die aufgrund fehlender Ziel-RNA nicht binden können, werden entfernt. Nach dem Verdau der RNA werden alle übrigen Sonden aus dem Gewebe herausgelöst und auf einen Visium CytAssist Spatial Gene Expression Slide übertragen (4a). Die Aufnahmebereiche auf diesem Objektträger enthalten ca. 5.000 barcodierte Spots (STS SD) oder ein Raster aus 11 Millionen barcodierten Quadraten (STS HD). Diese Barcodes werden durch Oligonukleotide codiert, welche an den Objektträger gebunden sind; sie sind spezifisch für die räumliche Position auf dem Objektträger (4b). Die transferierten Sonden werden an die stationären Oligonukleotide gebunden, verlängert und wieder gelöst (5). Die Sonden werden nun für die Erstellung der Sequenzier-Library verwendet und anschließend mit Illumina Short-reads sequenziert (6). Final können diese Daten mit dem histologischen Bild überlagert werden und man erhält die Genexpression als Karte mit einer maximalen Auflösung auf Einzelzell-Ebene (7).
Abbildung 1 | Spatial Transcriptomics Workflow. 1) FFPE-Gewebe-Block 2) Gewebeschnitte auf einem Glas-Objektträger 3) HE-gefärbtes Gewebe 4) Ligation der Sonden 4a+b) und Transfer in den Aufnahmebereich eines Visium CytAssist Spatial Gene Expression Slides, 5) Hybridisierung, Verlängerung und Lösen der Sonden, 6) Short-read Sequencing und 7) Überlagerung des histologischen Bildes mit der Genexpression.
Wir freuen uns, Sie bei der Entscheidung zwischen einem unserer Bulk-RNA-Sequenzierprodukten (Coding Transcriptome Sequencing oder Whole Transcriptome Sequencing), Single-Cell RNA Sequencing, Spatial Transcriptome Sequencing SD oder Spatial Transcriptome Sequencing HD unterstützen zu können.