Die Methylierungs-Sequenzierung ist ein Sequenzieransatz, der die epigenetischen Modifizierungen der DNA untersucht. Es gibt aktuell zwei Möglichkeiten zur Behandlung der DNA, um diese epigenetischen Modifikationen in der Sequenzierung sichtbar zu machen. Aber welche sollte man wählen? Wir möchten die Unterschiede der beiden Methoden beleuchten und zeigen, wie sie das Endergebnis beeinflussen.
Bevor wir uns die Methoden für die Vorbereitungen der DNA anschauen, wollen wir zunächst einen Blick auf die Grundlagen werfen. Die Epigenetik beschäftigt sich damit, wie Verhalten, Umwelt, Entwicklung oder Alter, aber auch Medikamente und Arzneimittel Veränderungen hervorrufen können, die die Funktionalität unserer Gene beeinflussen. Im Unterschied zu genetischen Veränderungen sind epigenetische Veränderungen reversibel. Sie verändern nicht die DNA-Sequenz selbst, sondern die Art und Weise, wie sie abgelesen wird. Ein Mechanismus epigenetischer Veränderungen ist die DNA-Methylierung: Dabei wird eine Methyl-Gruppe an Cytosin-Moleküle der DNA angefügt. Diese Modifizierungen können im speziellen NGS-Ansatz, der Methylierungs-Sequenzierung genannt wird, untersucht werden.
Wie bereits erwähnt gibt es aktuell zwei Möglichkeiten, um die DNA so zu behandeln, dass die Methylierungsmuster in der Sequenzierung sichtbar werden. Die beiden vorgestellten Methoden sind in Abbildung 1 zu sehen. Beide Methoden basieren auf dem Ansatz, dass unmethylierte Cytosin-Basen in Uracil-Basen umgewandelt werden. Sie unterscheiden sich allerdings darin, wie die Umwandlung durchgeführt wird. Eine bekannte Methode ist es, die methylierte DNA mit Bisulfit zu behandeln. In diesem Prozess werden unmethylierte Cytosin-Basen durch Deaminierung zu Uracil-Basen. Die methylierten 5-Methylcytosin-Moleküle (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosin-Moleküle (5hmC) reagieren nicht mit dem Bisulfit und bleiben unverändert. Der zweite Ansatz basiert auf enzymatischen Reaktionen. Daher wird dieser Ansatz auch enzymatische Methyl-Sequenzierung (EM-seq) genannt. Er besteht aus zwei Reaktionen, die 5mC und 5hmC erkennen. In der ersten Reaktion konvertieren die Enzyme Tet-Methylcytosin-Dioxygenase 2 (TET2) und T4-Phage beta-glucosyltransferase (T4-BGT) die 5mC- und 5hmC-Moleküle in 5-(β- Glucosyloxymethyl)-Cytosin (5gmC). Dieses kann nicht durch das Enzym Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3A (APOBEC3A) deaminiert werden. In der zweiten Reaktion deaminiert APOBEC3A die unmodifizierten Cytosin-Moleküle und wandelt sie in Uracil-Moleküle um. Nach dieser Umwandlung werden die Sequenzier-Librarys vorbereitet und sequenziert. Wie in Abbildung 1 zu sehen, enthält die sequenzierte DNA bei beiden Ansätzen Thymin-Basen an der komplementären Position zu den Uracil-Basen. Für die Auswertung und finale Identifizierung der methylierten Cytosin-Basen ist es notwendig, die behandelte Sequenz mit der Sequenz einer unbehandelten Referenz derselben Probe zu vergleichen.
Abbildung 1 | Vergleich der Bisulfit- und enzymatischen Behandlung als Vorbereitung für die Methylierungs-Sequenzierung.
5m(C) = 5-Methylcytosin; 5hm(C) = 5-Hydroxymethylcytosin; 5gm(C) = 5-(beta-Glucosyloxymethyl)-Cytosin.
Die sequenzierte DNA beider Methoden unterscheidet sich im Prinzip nicht. Dennoch gibt es einige Aspekte, die man bei der Wahl der Methode beachten sollte: Für eine vollständige Umwandlung mit Hilfe von Bisulfit wird die DNA recht grob behandelt und ist langen Inkubationszeiten, Temperaturunterschieden und hohen chemischen Konzentrationen ausgesetzt. Diese Bedingungen können zu DNA-Schäden, wie zum Beispiel Fragmentierungen, führen. Dadurch leiden die Größe der Inserts und die Qualität der Library. Somit können auch die Amplifizierung und das Mapping negativ beeinflusst werden. Die enzymatische Methode ist behutsamer und hat weniger Einfluss auf die abschließende Auswertung.
Auch wenn diese Methode komplexer ist, basiert CeGaT’s Methylierungs-Sequenzierungs-Produkt auf der enzymatischen Methyl-Sequenzierung. Dieser Ansatz bringt eine höhere Library-Qualität, weniger Bias und zuverlässigere Ergebnisse mit sich. Ihre DNA-Probe ist es wert, behutsam behandelt zu werden!