Die Unterschiede von Sequenzieradaptern – Finden Sie die richtige Kombination

Bei der Vorbereitung von Sequenzier-Librarys für Next-Generation-Sequencing (NGS)-Projekte werden an jede Probe Adapter angebracht. Diese Adapter sind wichtig, da sie die Bindung der Librarys an der Flow Cell ermöglichen. Doch nicht jeder Adapter ist gleich. Es sind verschiedene Kombinationsmöglichkeiten der Adapter-Bestandteile erhältlich. Die wichtigsten Aspekte zu diesen kurzen Sequenzen sind im Folgenden aufgeführt.

Zunächst ein paar grundsätzliche Hinweise zu Adaptern: Adapter sind ca. 80 Basen lange DNA-Moleküle, die das Insert auf beiden Seiten flankieren. Jeder Adapter besteht aus drei Komponenten. Der erste integrale Bestandteil des Adapters ist die Sequenz, die die Bindung an die Flow Cell ermöglicht. Zusätzlich befindet sich die Primer-Bindungsstelle im Adapter. Diese ermöglicht die Bindung der Polymerase während der Sequenzierung. Die dritte Komponente ist der individuelle Barcode, auch Index genannt. Dieser markiert jede Probe eindeutig. Das so-genannte Barcoding ermöglicht es, mehrere Proben für einen Sequenzierlauf zusammenzufassen und gemeinsam zu sequenzieren.
Nachdem nun die Hauptbestandteile eines Adapters klarer sind, zeigt Abbildung 1 Beispiele für verschiedene Adapterdesigns. Bei einer fertigen Sequenzier-Library binden die Primer-Bindungsstellen (SP1 und SP2) des Adapters direkt an das Insert. Daran schließen sich die einzelnen Indexregionen i5 und i7 an. An der Außenseite des Adapters befinden sich schließlich die Flow Cell-Bindungsstellen (P5 und P7). Der Hauptunterschied im Aufbau ist die Anzahl der Indexsequenzen, die den Inserts hinzugefügt werden. Man unterscheidet zwischen Einzel-Index- und Dual-Index-Adaptern.

Einzel-Index-Adapter enthalten nur eine Indexsequenz (i7). Während des Sequenzierungsprozesses wird der i7-Index nach dem vorwärts Read sequenziert. Es stehen bis zu 48 eindeutige Sequenzen zur Verfügung. Somit ist es möglich, bis zu 48 Librarys zu erstellen. Im Gegensatz dazu beinhaltet die Dual-Index-Sequenzierung, wie der Name schon sagt, zwei Index-Sequenzen. Zusätzlich zu einer i7-Sequenz wird eine weitere i5-Sequenz verwendet. Es wird empfohlen, ein Duales-Index-Arbeitsprotokoll zu verwenden, bei welchem die Librarys unterschiedliche, voneinander unabhängige Indexsequenzen erhalten. Diese Methode ermöglicht die eindeutige Markierung von bis zu 96 Proben. Eine zweite Möglichkeit der Dual-Index-Sequenzierung ist die kombinatorische Sequenzierung. Dabei teilen sich die Librarys entweder die i7- oder die i5-Sequenz.

Was muss jedoch bei der Wahl des Adapterdesigns für Ihr Sequenzierungsprojekt beachtet werden? Da bei Single-Index-Adaptern nur eine Indexsequenz verwendet wird, sind die Möglichkeiten der individuellen Kennzeichnung begrenzt. Daher eignet sich diese Methode für kleinere Projekte mit weniger Proben, die zusammen sequenziert werden müssen. Die Komplexität des Dual-Index Systems führt nicht nur zu einer höheren Anzahl individuell markierbarer Proben, sondern auch zu einer höheren Genauigkeit bei der Zuordnung der Reads nach der Sequenzierung. Diesen Vorteil hat man vor allem dann, wenn beide Indizes, i7 und i5, sich in jeder Probe unterscheiden. Bei einer großen Anzahl von Proben minimiert dieser Ansatz daher die Möglichkeit der Verwechslung zwischen Reads verschiedener Proben.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Adapter die Moleküle sind, die sicherstellen, dass Ihre Probe auf einer entsprechenden Flow Cell sequenziert werden kann. Außerdem ermöglichen sie die individuelle Markierung einer Probe. Durch Unterschiede im Aufbau der Adaptersequenzen kann dies auf zwei verschiedene Arten geschehen: mit Hilfe der Single-Index-Sequenzierung oder Dual-Index-Sequenzierung. Welche Sequenzierung sich für Ihr Projekt am besten eignet, hängt unter andrem von der Anzahl Ihrer Proben ab. Finden Sie die richtige Adapter-Kombination für Ihr Sequenzierprojekt!