Short-Read Sequenzier-Librarys werden in der Regel nicht einzeln sequenziert. Auf einer einzigen Flow Cell können aufgrund individueller Indizes und entsprechender Pooling-Möglichkeiten mehrere Proben parallel sequenziert werden. Eine gut gewählte Strategie kann Zeit und Geld sparen und somit Ihr Projekt optimieren.
Aber was genau bedeutet ‘Pooling’? Pooling steht für das Mischen einzelner Proben. In diesem Artikel wird das Vorgehen beim Pooling von Sequenzier-Librarys erklärt. Es soll vor allem darum gehen, was beim Mischen der Sequenzier-Librarys zu beachten ist.
Das Poolen von Proben kann nur mit individuell-barcodierten Librarys durchgeführt werden, wobei jeder Barcode nur einmal im Sequenzierpool vorhanden sein darf. Die Barcodierung selbst erfolgt während der Library-Erstellung. Werden Proben ohne Barcode gepoolt, können die sequenzierten Reads am Ende nicht ihrer Ausgangsprobeprobe zugeordnet werden. Alle Proben in einem Sequenzierpool werden außerdem mit der gleichen Leselänge sequenziert. Daher müssen beide Faktoren – Barcodierung und Sequenziermodus – sorgfältig berücksichtigt werden.
Wenn alle Voraussetzungen für das Pooling erfüllt sind, gibt es zwei gängige Strategien: äquimolares Pooling und nicht-äquimolares Pooling. Der Unterschied zwischen den beiden Strategien liegt im Verhältnis der im Pool vorhandenen Proben. Beim äquimolaren Pooling sind alle Proben im gleichen Verhältnis vorhanden, während beim nicht-äquimolaren Pooling die Proben in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt werden. Ein Hauptfaktor dafür, ob Proben äquimolar oder nicht-äquimolar gepoolt werden sollten, ist folglich das Verhältnis des erforderlichen Outputs der Proben.
Wir wollen dies anhand eines Beispiels genauer erläutern (siehe Abbildung 1). Wir nehmen an, dass wir drei Proben haben, die in einem Pool sequenziert werden sollen. Nach der Erstellung der Librarys liegen sie zunächst in unterschiedlichen Konzentrationen vor. Bevor das Pooling durchgeführt wird, werden die Librarys normalisiert, so dass alle drei Librarys die gleiche Konzentration aufweisen. Dieser Zwischenschritt ist nicht zwingend erforderlich, kann aber die Erstellung des Pools im nächsten Schritt vereinfachen. Abbildung 1 zeigt im Weiteren, wie zwei Sequenzierpools erzeugt werden: ein äquimolarer und ein nicht-äquimolarer Pool. Der äquimolare Pool enthält die gleichen Anteile der Librarys, während beim nicht-äquimolaren Pool die Librarys im Verhältnis 3:2:1 gemischt werden. Schließlich werden während der Sequenzierung Reads für jede Library erzeugt. Diese Reads können dann ihrer Ausgangsprobe zugeordnet werden. Die Read-Verteilung der drei Librarys ist für den äquimolaren Pool gleich. Die Verteilung der Reads für den nicht-äquimolaren Pool entspricht dem Verhältnis der Librarys im Pool.
Abbildung 1 | Workflow der Pooling Strategien und deren Sequenzierergebnisse
Das Pooling beeinflusst folglich das Ergebnis eines jeden Sequenzierungsprojekts. Die richtige Strategie hängt davon ab, wie viele Indizes zur Verfügung stehen, auf welcher Flow Cell der Pool sequenziert wird und wie hoch der gewünschte Output pro Probe ist. Wir haben all diese Punkte für unsere Produkte im Blick – das Pooling von Proben ist unsere tägliche Arbeit. Es lohnt sich, einmal über Pooling nachzudenken, wenn man ein Sequenzierprojekt startet.