{"id":86817,"date":"2025-12-04T10:00:00","date_gmt":"2025-12-04T09:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/cegat.com\/?p=86817"},"modified":"2025-12-04T09:27:24","modified_gmt":"2025-12-04T08:27:24","slug":"korrelation-von-probenqualitaet-und-output-bei-pacbios-hifi-sequenzierung","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cegat.com\/de\/korrelation-von-probenqualitaet-und-output-bei-pacbios-hifi-sequenzierung\/","title":{"rendered":"Korrelation von Probenqualit\u00e4t und Output bei PacBios HiFi-Sequenzierung"},"content":{"rendered":"<div class=\"fusion-fullwidth fullwidth-box fusion-builder-row-1 fusion-flex-container has-pattern-background has-mask-background nonhundred-percent-fullwidth non-hundred-percent-height-scrolling\" style=\"--link_hover_color: var(--awb-color2);--link_color: var(--awb-color2);--awb-border-radius-top-left:0px;--awb-border-radius-top-right:0px;--awb-border-radius-bottom-right:0px;--awb-border-radius-bottom-left:0px;--awb-flex-wrap:wrap;\" ><div class=\"fusion-builder-row fusion-row fusion-flex-align-items-flex-start fusion-flex-content-wrap\" style=\"max-width:1248px;margin-left: calc(-4% \/ 2 );margin-right: calc(-4% \/ 2 );\"><div class=\"fusion-layout-column fusion_builder_column fusion-builder-column-0 fusion_builder_column_1_1 1_1 fusion-flex-column\" style=\"--awb-bg-size:cover;--awb-width-large:100%;--awb-margin-top-large:0px;--awb-spacing-right-large:1.92%;--awb-margin-bottom-large:20px;--awb-spacing-left-large:1.92%;--awb-width-medium:100%;--awb-order-medium:0;--awb-spacing-right-medium:1.92%;--awb-spacing-left-medium:1.92%;--awb-width-small:100%;--awb-order-small:0;--awb-spacing-right-small:1.92%;--awb-spacing-left-small:1.92%;\" data-scroll-devices=\"small-visibility,medium-visibility,large-visibility\"><div class=\"fusion-column-wrapper fusion-column-has-shadow fusion-flex-justify-content-flex-start fusion-content-layout-column\"><div class=\"fusion-text fusion-text-1\" style=\"--awb-content-alignment:justify;\"><p>F\u00fcr PacBios HiFi-Sequenzierungsansatz ist hochmolekulare DNA der Schl\u00fcssel f\u00fcr die erfolgreiche Generierung hochpr\u00e4ziser Long-Reads, die auch als HiFi-Reads bekannt sind. Die Qualit\u00e4t der DNA beeinflusst nicht nur die L\u00e4nge der DNA-Molek\u00fcle, sondern auch den gesamten Output der HiFi-Sequenzierung.<\/p>\n<p>Die DNA ist allerdings anf\u00e4llig f\u00fcr verschiedene Arten von Sch\u00e4digungen, die zum Beispiel durch<\/p>\n<ul>\n<li>zahlreiche unn\u00f6tige Frost-Tau-Zyklen,<\/li>\n<li>\u00fcberm\u00e4\u00dfiges Pipettieren,<\/li>\n<li>hohe Temperaturen, extreme pH-Werte, interkalierende fluoreszierende Farbstoffe, ultraviolette Strahlung oder<\/li>\n<li>Abbau der DNA aufgrund von Formalin-Fixierung und Lagerung in FFPE-Proben<\/li>\n<\/ul>\n<p>zu DNA mit geringer Qualit\u00e4t f\u00fchren k\u00f6nnen. Zus\u00e4tzlich k\u00f6nnen Kontaminationen mit einzelstr\u00e4ngiger DNA, RNA, Proteinen, Farbstoffen oder Salzen die DNA-Qualit\u00e4t und das Gesamtergebnis der Sequenzierung beeinflussen. W\u00e4hrend der Vorbereitung der PacBio Library werden Haarnadel-Adapter (\u201ehairpin adapters\u201c) an beide Seiten der DNA-Fragmente gebunden, um so eine zirkul\u00e4re Vorlage f\u00fcr die Polymerase zu schaffen.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><div class=\"fusion-layout-column fusion_builder_column fusion-builder-column-1 fusion_builder_column_3_5 3_5 fusion-flex-column\" style=\"--awb-bg-size:cover;--awb-width-large:60%;--awb-margin-top-large:0px;--awb-spacing-right-large:3.2%;--awb-margin-bottom-large:20px;--awb-spacing-left-large:3.2%;--awb-width-medium:60%;--awb-order-medium:0;--awb-spacing-right-medium:3.2%;--awb-spacing-left-medium:3.2%;--awb-width-small:100%;--awb-order-small:0;--awb-spacing-right-small:1.92%;--awb-spacing-left-small:1.92%;\" data-scroll-devices=\"small-visibility,medium-visibility,large-visibility\"><div class=\"fusion-column-wrapper fusion-column-has-shadow fusion-flex-justify-content-flex-start fusion-content-layout-column\"><div class=\"fusion-text fusion-text-2\" style=\"--awb-content-alignment:justify;\"><p>Nach der Vorbereitung der Library und der Bindung der Polymerase werden die Libraries f\u00fcr die Sequenzierung auf die PacBio SMRT Cell geladen. Jede SMRT Cell besteht aus einer vordefinierten Anzahl an winzigen Vertiefungen, die \u201eZero-Mode Waveguides\u201c (ZMWs) genannt werden. In diesen ZMWs werden einzelne Library-Molek\u00fcl gebunden und der Baseneinbau durch die Polymerase wird in Echtzeit gemessen und aufgenommen. Das Ziel ist es, die SMRT Cell so zu beladen, dass in jedem ZMW ein einzelnes DNA-Library-Molek\u00fcl gebunden ist. W\u00e4hrend der Sequenzierung wird die zirkul\u00e4re DNA in sich wiederholenden Durchl\u00e4ufen sequenziert. Nach dem Sequenzierprozess werden die Adapter-Sequenzen von den fortlaufenden Polymerase-Reads entfernt und eine Konsensus-Sequenz wird auf Grundlage aller Sub-Reads erstellt. Diese Konsensus-Reads werden dann hinsichtlich ihrer Qualit\u00e4t gefiltert, wodurch nur noch hochpr\u00e4zise HiFi-Reads \u00fcbrigbleiben. Folglich wird aus jedem besetzten ZMW ein HiFi-Read, vorausgesetzt es besteht die Qualit\u00e4tspr\u00fcfung.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><div class=\"fusion-layout-column fusion_builder_column fusion-builder-column-2 fusion_builder_column_2_5 2_5 fusion-flex-column\" style=\"--awb-padding-top:20px;--awb-padding-right:40px;--awb-padding-bottom:20px;--awb-padding-left:20px;--awb-bg-color:var(--awb-custom_color_3);--awb-bg-color-hover:var(--awb-custom_color_3);--awb-bg-size:cover;--awb-width-large:40%;--awb-margin-top-large:0px;--awb-spacing-right-large:4.8%;--awb-margin-bottom-large:20px;--awb-spacing-left-large:4.8%;--awb-width-medium:40%;--awb-order-medium:0;--awb-spacing-right-medium:4.8%;--awb-spacing-left-medium:4.8%;--awb-width-small:100%;--awb-order-small:0;--awb-spacing-right-small:1.92%;--awb-spacing-left-small:1.92%;\" data-scroll-devices=\"small-visibility,medium-visibility,large-visibility\"><div class=\"fusion-column-wrapper fusion-column-has-shadow fusion-flex-justify-content-flex-start fusion-content-layout-column\"><div class=\"fusion-text fusion-text-3\" style=\"--awb-content-alignment:justify;--awb-font-size:14px;\"><p style=\"text-align: left;\"><strong>Auf einen Blick<\/strong><\/p>\n<ul>\n<li style=\"text-align: left;\">DNA mit geringer Qualit\u00e4t ist oft st\u00e4rker fragmentiert, was zu k\u00fcrzeren DNA-Fragmenten f\u00fchrt.<\/li>\n<li style=\"text-align: left;\">Verunreinigungen und Kontaminationen k\u00f6nnen die Bindung des DNA-Polymerase-Komplexes vermindern oder sogar verhindern.<\/li>\n<li style=\"text-align: left;\">Die durchschnittliche DNA-L\u00e4nge und die SMRT Cell-Beladung korrelieren mit dem Output<\/li>\n<li style=\"text-align: left;\">Gutes Startmaterial und hochmolekualre DNA sind unerl\u00e4sslich f\u00fcr ausreichend Output und qualitativ hochwertige Ergebnisse.<\/li>\n<\/ul>\n<\/div><\/div><\/div><div class=\"fusion-layout-column fusion_builder_column fusion-builder-column-3 fusion_builder_column_1_1 1_1 fusion-flex-column\" style=\"--awb-bg-size:cover;--awb-width-large:100%;--awb-margin-top-large:0px;--awb-spacing-right-large:1.92%;--awb-margin-bottom-large:20px;--awb-spacing-left-large:1.92%;--awb-width-medium:100%;--awb-order-medium:0;--awb-spacing-right-medium:1.92%;--awb-spacing-left-medium:1.92%;--awb-width-small:100%;--awb-order-small:0;--awb-spacing-right-small:1.92%;--awb-spacing-left-small:1.92%;\" data-scroll-devices=\"small-visibility,medium-visibility,large-visibility\"><div class=\"fusion-column-wrapper fusion-column-has-shadow fusion-flex-justify-content-flex-start fusion-content-layout-column\"><div class=\"fusion-text fusion-text-4\" style=\"--awb-content-alignment:justify;\"><p>Da die Anzahl der ZMWs auf einer SMRT Cell vordefiniert ist, korreliert der generierte Output direkt mit der L\u00e4nge der DNA-Molek\u00fcle in der Library und der Beladung der SMRT Cell. Beide Parameter (durchschnittliche DNA-L\u00e4nge und SMRT Cell-Beladung) werden durch die DNA-Qualit\u00e4t beeinflusst, da DNA mit geringer Qualit\u00e4t h\u00e4ufig eine h\u00f6here Fragmentierung aufweist und Verunreinigungen enthalten kann, die das Binden des DNA-Polymerase-Komplexes an die SMRT Cell entweder vermindern oder sogar verhindern k\u00f6nnen. Um diesen Zusammenhang zu verdeutlichen, zeigt Abbildung 1 eine vereinfachte Version des PacBio Sequenzierprozesses. In diesem Beispiel nehmen wir an, dass die SMRT Cell insgesamt 5 ZMWs hat und die linke Probe DNA mit geringer Qualit\u00e4t (fragmentiert und Verunreinigungen enthaltend) besitzt, w\u00e4hrend die rechte Probe hochmolekulare DNA enth\u00e4lt. Die Verunreinigungen in der Probe mit geringer DNA-Qualit\u00e4t k\u00f6nnen zu reduzierter Bindung in den ZMWs f\u00fchren. In unserem Beispiel werden dadurch nur 2 der 5 ZMWs beladen, w\u00e4hrend bei der qualitativ hochwertigen Probe 4 der 5 ZMWs beladen werden. Bitte beachten Sie, dass die SMRT Cells im PacBio-Workflow in der Regel nie vollst\u00e4ndig beladen werden k\u00f6nnen . Zus\u00e4tzlich nehmen wir an, dass die DNA der Probe mit geringer DNA-Qualit\u00e4t durch Fragmentierung k\u00fcrzere DNA-Molek\u00fcle besitzt (8 bp) im Vergleich zur Probe mit hochmolekularer DNA (16 bp). Da aus jedem beladenen ZMW in der Theorie ein HiFi-Read entsteht, wird der gesamte Output der SMRT Cell durch die Multiplikation der Anzahl der beladenen ZMWs (= HiFi -Reads) mit der durchschnittlichen L\u00e4nge der DNA-Molek\u00fcle berechnet. Daraus ergibt sich f\u00fcr die Probe mit geringer DNA-Qualit\u00e4t ein Output von 8 bp x 2 beladene ZMWs = 16 bp. Im Gegensatz dazu hat die Probe mit der hochmolekularen DNA einen Output von 16 bp x 4 beladene ZMWs = 64 bp.<\/p>\n<p>Nat\u00fcrlich ist dies ein fiktives Beispiel, aber es hebt die Wichtigkeit und den Einfluss des Startmaterials auf den Output hervor: schlechtes Startmaterial mit geringer DNA-Qualit\u00e4t f\u00fchrt zu k\u00fcrzeren HiFi-Reads und weniger Output. Daher ist es essenziell, das Startmaterial mit einzubeziehen, wenn der Output in Gigabasen eingesch\u00e4tzt werden soll. Die Anzahl der HiFi-Reads k\u00f6nnte hier eine verl\u00e4sslichere Einsch\u00e4tzung geben. Gutes Startmaterial und hochmolekulare DNA sind unerl\u00e4sslich f\u00fcr die Erstellung langer Libraries, f\u00fcr Sequenziererfolge und f\u00fcr qualitativ hochwertige Ergebnisse. Daher haben wir f\u00fcr Sie Flyer mit Tipps zur <a href=\"\/wp-content\/uploads\/2025\/08\/CeGaT_RPS_Flyer_DNA_Extraction_for_PacBio_HiFi_Sequencing.pdf\">DNA-Extraktion<\/a> und <a href=\"\/wp-content\/uploads\/2025\/05\/RPS_Additional-Information_Preparing_DNA_for_PacBio.pdf\">Vorbereitung der DNA<\/a> f\u00fcr PacBios HiFi-Sequenzierung erstellt.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><div class=\"fusion-layout-column fusion_builder_column fusion-builder-column-4 fusion_builder_column_1_1 1_1 fusion-flex-column\" style=\"--awb-bg-size:cover;--awb-width-large:100%;--awb-margin-top-large:0px;--awb-spacing-right-large:1.92%;--awb-margin-bottom-large:20px;--awb-spacing-left-large:1.92%;--awb-width-medium:100%;--awb-order-medium:0;--awb-spacing-right-medium:1.92%;--awb-spacing-left-medium:1.92%;--awb-width-small:100%;--awb-order-small:0;--awb-spacing-right-small:1.92%;--awb-spacing-left-small:1.92%;\" data-scroll-devices=\"small-visibility,medium-visibility,large-visibility\"><div class=\"fusion-column-wrapper fusion-column-has-shadow fusion-flex-justify-content-flex-start fusion-content-layout-column\"><div class=\"fusion-image-element \" style=\"text-align:center;--awb-liftup-border-radius:3px;--awb-caption-title-font-family:var(--h2_typography-font-family);--awb-caption-title-font-weight:var(--h2_typography-font-weight);--awb-caption-title-font-style:var(--h2_typography-font-style);--awb-caption-title-size:var(--h2_typography-font-size);--awb-caption-title-transform:var(--h2_typography-text-transform);--awb-caption-title-line-height:var(--h2_typography-line-height);--awb-caption-title-letter-spacing:var(--h2_typography-letter-spacing);\"><div class=\"awb-image-frame awb-image-frame-1 imageframe-liftup imageframe-1\" style=\"max-width:500px;\"><span class=\" fusion-imageframe imageframe-none imageframe-1\" style=\"border-radius:3px;\"><a href=\"https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE.png\" class=\"fusion-lightbox\" data-rel=\"iLightbox[e95424cb95a9dae6b7c]\" data-title=\"RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE\" title=\"RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE\"><img decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"1647\" alt=\"Einfluss des Startmaterials auf den Output\" src=\"https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE.png\" data-orig-src=\"https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE.png\" class=\"lazyload img-responsive wp-image-86803\" srcset=\"data:image\/svg+xml,%3Csvg%20xmlns%3D%27http%3A%2F%2Fwww.w3.org%2F2000%2Fsvg%27%20width%3D%271024%27%20height%3D%271647%27%20viewBox%3D%270%200%201024%201647%27%3E%3Crect%20width%3D%271024%27%20height%3D%271647%27%20fill-opacity%3D%220%22%2F%3E%3C%2Fsvg%3E\" data-srcset=\"https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE-200x322.png 200w, https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE-400x643.png 400w, https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE-600x965.png 600w, https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE-800x1287.png 800w, https:\/\/cegat.com\/wp-content\/uploads\/2025\/11\/RPS_Blog_Correlation-of-input-material-and-output_DE.png 1024w\" data-sizes=\"auto\" data-orig-sizes=\"(max-width: 768px) 100vw, 1024px\" \/><\/a><\/span><\/div><\/div><div class=\"fusion-text fusion-text-5\" style=\"--awb-content-alignment:justify;--awb-font-size:14px;--awb-margin-top:10px;\"><p><strong>Abbildung 1 | Einfluss des Startmaterials auf den Output.<\/strong> Proben mit geringer DNA-Qualit\u00e4t k\u00f6nnen zu k\u00fcrzeren DNA-Fragmenten und damit zu k\u00fcrzeren Sequenzierlibraries f\u00fchren. Zus\u00e4tzlich k\u00f6nnen Verunreinigungen in Proben mit geringer DNA-Qualit\u00e4t eine reduzierte Binungseffizienz in den ZMWs beg\u00fcnstigen. Folglich werden im Vergleich zu Proben mit hochmolekularer DNA weniger und k\u00fcrzere HiFi-Reads w\u00e4hrend des Sequenzierprozesses erzeugt, was letztendlich zu einem reduzierten Output f\u00fchrt.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":25,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[203,205],"tags":[],"class_list":["post-86817","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-dna-de","category-sequenzierung-de"],"yoast_head":"<!-- This site is optimized with the Yoast SEO plugin v27.4 - https:\/\/yoast.com\/product\/yoast-seo-wordpress\/ -->\n<title>Korrelation von Probenqualit\u00e4t und Output bei PacBios HiFi-Sequenzierung<\/title>\n<meta name=\"description\" content=\"In diesem Blogartikel sprechen wir \u00fcber Korrelation von Probenqualit\u00e4t und Output bei 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