Weil RNA nicht gleich RNA ist – Die Unterschiede von RNA Sequenzierungs- ansätzen

Die RNA-Sequenzierung ist ein genomischer Ansatz mit vielen verschiedenen Möglichkeiten, welche in den letzten Jahren viele Innovationen und neue therapeutische Optionen ermöglichte. Doch nicht jede RNA ist gleich. Worin bestehen die Hauptunterschiede zwischen den Molekülen? Was ist für Ihr Projekt von Bedeutung und was müssen Sie beachten? Wir möchten diese Fragen beantworten.

Bevor Sie ein RNA-Sequenzierungsprojekt starten, ist es wichtig, sich zunächst über die Unterschiede zwischen den RNA-Molekülen bewusst zu werden. Beginnen wir mit den drei Haupttypen. Diese werden aufgrund ihrer Funktion unterschieden und werde Boten-RNA („messenger RNA“, mRNA), Transfer-RNA (tRNA) und ribosomale RNA (rRNA) genannt. Die mRNA dient als Vorlage für die Proteinsynthese. Sie wird daher auch als kodierende RNA bezeichnet. Die Transfer-RNA (tRNA) transportiert Aminosäuren für die Proteinsynthese zu den Ribosomen. Die ribosomale RNA hingegen spielt bei der Translation eine strukturelle und katalytische Rolle.

Allerdings fallen nicht alle RNA-Moleküle in diese Gruppen. Neben der funktionellen Differenzierung können RNA-Moleküle auch nach ihrer Größe unterteilt werden. Dabei wird zwischen Molekülen größer als 200 Nukleotide und kleiner als 200 Nukleotide unterschieden. Folglich gibt es so genannte kleine, nicht-kodierende RNAs („small non-coding RNAs“, sRNA) und lange, nicht-kodierende RNAs („long non-coding RNAs“, lncRNA). Beide Arten werden nicht in Proteine übersetzt, sind aber weit verbreitet und spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation. Zwei bekannte Arten von kleinen, nicht-kodierenden RNAs sind microRNAs (miRNAs) und small interfering RNAs (siRNAs). Beide sind an RNA-Interferenzen (RNAi) beteiligt, um Gene auszuschalten und somit die Genexpression zu regulieren.

Mit diesem Wissen über die verschiedenen RNA-Typen kann man sich an die Planung eines Sequenzierprojektes machen. Werfen Sie hierzu bitte einen Blick auf Abbildung 1. Zunächst muss die RNA aus dem Ausgangsmaterial isoliert werden. Bereits hier erfolgt eine erste Unterscheidung. Das liegt daran, dass nicht alle Isolierungskits für alle RNA-Moleküle gleich gut funktionieren. Mit den meisten Kits können RNA-Moleküle, die kleiner als 100 bp sind, nicht ausreichend isoliert werden. Daher müssen spezielle Kits für die Isolierung kleiner RNAs verwendet werden. Überprüfen Sie daher bitte immer, ob Ihr bevorzugtes Kit für den gewünschten RNA-Typ geeignet ist. Nach erfolgreicher Isolierung ist der Arbeitsablauf für die Sequenzierung kleiner RNAs recht einfach. Mit einem geeigneten Kit für die Erstellung der Library wird die RNA für die Sequenzierung vorbereitet.

Nach der Isolierung der größeren RNA-Moleküle können Sie zwischen zwei Anwendungen wählen. Der häufigste Ansatz ist die Sequenzierung kodierender RNA, der so-genannten mRNA-Sequenzierung. Für diesen Ansatz findet eine Selektion der mRNA statt. Dies geschieht mit Hilfe von Poly-T-Oligonukleotiden, die an magnetische Beads gebunden sind, an denen nur die mRNA mit ihrem Poly-A-Ende binden kann. Anschließend kann die Sequenzier-Library auf Basis der mRNA-Moleküle erstellt werden. Da die meisten Eukaryoten das notwendige Poly-A Ende an der mRNA besitzen, kann dieser Ansatz für die Analyse eukaryotischer Zellen verwendet werden. Im Gegensatz dazu ist der mRNA-Sequenzierungsansatz für bakterielle Proben aufgrund des fehlenden Poly-A-Endes ungeeignet.

Was ist nun aber der Unterschied zwischen der mRNA-Sequenzierung und der Sequenzierung der gesamten RNA? Bei der Sequenzierung der gesamten RNA werden sowohl mRNA als auch lange, nicht-kodierende RNA-Moleküle mit einer Größe von über 100 bp erfasst. Nach der Isolierung besteht der Großteil der isolierten RNA-Moleküle aus rRNA. Ihr Informationsgehalt ist jedoch für die meisten Forschungsfragen zweitrangig. Deshalb wird empfohlen, die rRNA abzureichern, bevor die Librarys erstellt und die Sequenzierung durchgeführt werden.

Die verschiedenen Funktionen und Größen von RNA-Molekülen sollten also vor der Sequenzierung berücksichtigt werden. Welchen RNA-Typen Sie untersuchen wollen, beeinflusst die Wahl des richtigen RNA-Isolierungskits und die Schritte während der Library-Erstellung. RNA ist eben nicht gleich RNA! Deshalb bieten wir Small RNA Sequencing, Coding Transcriptome Sequencing und Whole Transcriptome Sequencing an. Wir helfen Ihnen gerne bei der Auswahl des passenden Produktes für Ihr Projekt.

Grafik Vergleich der Ziel-RNA-Moleküle und der wichtigsten Schritte der verschiedenen RNA-Sequenzierungsansätze.

Abbildung 1 | Unterschiede in den RNAs. Vergleich der Ziel-RNA-Moleküle und der wichtigsten Schritte der verschiedenen RNA-Sequenzierungsansätze.

23. Januar 2025 | RNA, Sequenzierung |