Eines der derzeit meistdiskutierten Themen ist die Proteomik, welche die qualitative und quantitative Analyse von Proteinen im Hochdurchsatz ermöglicht. In den nächsten Minuten wollen wir diskutieren, wie die Integration der Proteomik die Entdeckung neuer Biomarker unterstützen kann, welche Typen von Biomarkern es gibt, und einige technische Lösungen vorstellen.
Potenzielle Kandidaten für molekulare Biomarker lassen sich auf unterschiedlichen Ebenen finden. Auf DNA-Ebene kann die Detektion von Veränderungen beispielsweise helfen, Erbkrankheiten und genetische Prädispositionen aufzuklären. RNA-Biomarker hingegen können von Vorteil sein, wenn aktive zelluläre Prozesse untersucht werden. Sie zeigen, welche Gene tatsächlich exprimiert werden. Allerdings garantiert die Expression nicht, dass auch ein funktionelles Protein entsteht. Eine alleinige Fokussierung auf genomische oder transkriptomische Daten kann so zur Priorisierung von Zielstrukturen führen, welche auf Proteinebene keine funktionelle Relevanz besitzen. Dies stellt ein zentrales Risiko für die Arzneimittelentwicklung und die translationale Forschung dar.
Um diese Lücke zu schließen, sind Ansätze erforderlich, welche funktionelle Veränderungen auf Proteinebene erfassen. An dieser Stelle liefert das Proteom zusätzliche Erkenntnisse für Krankheitsprognosen und reagiert empfindlicher auf geringfügige Veränderungen im Krankheitsverlauf. Darüber hinaus sind Proteine die zentralen Akteure, welche zelluläre Signalwege und Prozesse direkt steuern (Abbildung 1).
Abbildung 1 | Das Potential von Proteomik für die Entdeckung neuer Biomarker.
Da somit Proteine die funktionell entscheidende molekulare Ebene darstellen, ist die Wahl einer geeigneten Methode zur Entdeckung neuer Biomarker ein naheliegender nächster Schritt. Dieser erweist sich jedoch als komplexer, als er auf den ersten Blick erscheint. Das menschliche Genom codiert für die große Anzahl von ca. 20.000 Proteinen, welche sich durch Splicingvarianten und posttranslationale Modifikationen zusätzlich unterscheiden. Einige Proteine sind zudem nur kurzzeitig stabil und weisen eine hohe Komplexität in ihrer Zusammensetzung und Struktur auf. All diese Eigenschaften erschweren ihre Charakterisierung und Quantifizierung.
Mit der Zeit haben sich viele Methoden auf dem Markt etabliert, um einzelne Biomarker verlässlich zu detektieren. Jedoch sind Erkrankungen dynamische Prozesse, und das Einbeziehen einzelner Biomarker reicht in manchen Fällen nicht aus. Viele Proteine gemeinsam in einem Ansatz zu detektieren, um komplexe Zusammenhänge zu verstehen, bleibt eine Herausforderung. Hinzu kommt, dass krankheitsassoziierte Proteine häufig nur einen sehr geringen Anteil der Gesamtproteinmasse ausmachen.
Benötigt werden also Methoden, welche nicht nur ein breites Spektrum erfassen, sondern auch sensitiv und gleichzeitig ausreichend spezifisch für seltene Proteine sind. Hierfür sind derzeit zwei Ansätze gängig: Massenspektrometrie (MS) und affinitätsbasierte Technologien.
Massenspektrometrie nutzt Fragmentierung und die Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse einzelner Moleküle, um Proteine zu identifizieren. Das Fragmentierungsmuster und das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis erlauben Rückschlüsse auf die in einer Probe vorkommenden Moleküle sowie auf posttranslationale Modifikationen von Proteinen.
Affinitätsbasierte Methoden hingegen nutzen Antikörper, die spezifisch an Proteine binden. Ein Beispiel hierfür ist die Olink®’s Proximity Extension Assay (PEA)-Technologie (Abbildung 2). Hier werden zwei Antikörper eingesetzt, was zugleich die Spezifität des Ansatzes erhöht. Beide Antikörper sind mit komplementären Oligonukleotidsequenzen markiert. Nur wenn zwei passende Antikörper binden, hybridisieren die Oligonukleotidsequenzen und werden anschließend durch eine Polymerase amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden anschließend mittels Next-Generation Sequenzing (NGS) sequenziert. Die Sequenzen sind spezifisch für das jeweilige Protein, sodass sich dessen Abundanz sowohl sensitiv als auch spezifisch analysieren lässt.
Die Entscheidung zwischen MS und affinitätsbasierten Methoden zur Entdeckung neuer Biomarker – oder deren Kombination – hängt von der jeweiligen Forschungsfrage ab. Beide Ansätze haben ihre Stärken und Schwächen, da sie unterschiedliche Teile des Proteoms abdecken und folglich nicht austauschbar sind. Die Massenspektrometrie ist insbesondere für explorative Studien von großem Wert, da sie die Identifikation neuer Proteine oder posttranslationaler Modifikationen ermöglicht. Affinitätsbasierte Methoden hingegen ermöglichen eine hochsensitive und reproduzierbare Analyse vordefinierter Proteinpanels und eignen sich daher besonders für Studien mit größeren Kohorten sowie für translationale und klinische Forschungsanwendungen.
Zusammengefasst ist die Wahl des geeigneten Ansatzes ein entscheidender Schritt in der Biomarker-Entdeckung. Gerne unterstützen wir Sie während dieses Entscheidungsprozesses und helfen Ihnen dabei, Olink®‘s PEA-Technologie in Ihre Biomarker-Forschung zu integrieren. Mehr zu unserm Proteomics Service.
Abbildung 2 | PEA Technologie (Olink)