Wenn man sich mit Next-Generation Sequencing beschäftigt, kommt man um den Begriff Flow Cell nicht herum. Eine Flow Cell ist der physische Raum, in dem die Sequenzierung stattfindet. Es gibt verschiedene Arten von Flow Cells für dieselbe Sequenzierungsplattform. Doch wie ist eine Flow Cell aufgebaut, so dass die Sequenzierung auf ihr funktionieren kann? Was sind Cluster, was bedeutet Lane Loading, und welche Bedeutung hat es für die Planung von Projekten? Wir möchten diese Fragen gerne beantworten.
Flow Cells von Illumina sind hohle Glasträger mit einzelnen Fluidkanälen, sogenannten Lanes. Der Aufbau einer Illumina Flow Cell ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Oberflächen sind mit gleichmäßig verteilten Vertiefungen, so genannten Nanowells, strukturiert. In diesen Nanowells befinden sich Oligonukleotide, die die Bindung der Sequenzier-Library ermöglichen. Zu Beginn des Sequenzierungslaufs werden aus den in den Nanowells gebundenen Library-Molekülen Cluster gebildet. Diese Cluster bestehen aus Tausenden von Kopien einzelsträngiger DNA-Fragmente, von denen jeder einzelne später einen Sequenzier-Read ergibt. Diese Reads werden bei der Sequenzierung erzeugt, indem fluoreszenzmarkierte Nukleotide an den DNA-Vorlagestrang gebunden werden. Kameras erfassen diesen Prozess.
Abbildung 1 | Exemplarischer Aufbau einer Illumina Flow Cell mit acht Lanes.
Das macht deutlich, dass einige Komponenten einer Flow Cell, wie z. B. die Nanowells, von technologischer Relevanz sind. Die Unterteilung einer Flow Cell in Lanes führt darüber hinaus zu Vorteilen bei der Anwendung. Aber warum? Lanes unterteilen die Flow Cell physisch. Sie verfügen über eigene Ein- und Ausgänge, so dass ein Library-Pool nicht nur auf die gesamte Flow Cell, sondern auch auf eine oder mehrere separate Lanes geladen werden kann. Dieser Vorgang wird als Lane Loading bezeichnet. Dadurch können mehrere unabhängige Sequenzierpools, auch mit identischen Barcodes, auf derselben Flow Cell sequenziert werden. Obligatorisch für die parallele Sequenzierung ist der Sequenziermodus: er muss für die gesamte Flow Cell gleich gewählt werden. Der verfügbare Output pro Lane hängt von den insgesamt möglichen Clustern der Flow Cell ab. Wie oben bereits beschrieben, können Cluster nur in den Nanowells erzeugt werden, die wiederum gleichmäßig auf der Flow Cell verteilt sind. Das bedeutet, dass für jede Lane die gleiche Anzahl von Clustern erzeugt werden kann. Somit kann der maximale Output pro Flow Cell durch die Anzahl der Lanes geteilt werden. Die Möglichkeit des Lane Loadings bietet daher eine höhere Flexibilität für Sequenzierprojekte.
Einige Strukturen einer Illumina Flow Cell sind also nicht nur von technischer Bedeutung, sondern sollten auch bei der Projektplanung berücksichtigt werden. Die Anzahl der Cluster bestimmt den maximal möglichen Output der verschiedenen Flow Cell Typen. Sollten diese Typen jedoch nicht Ihren Anforderungen entsprechen, gibt es Lane-Loading-Optionen. Wir bieten Ihnen an, Ihre Library-Pools entweder auf einer kompletten Flow Cell oder auf einer oder mehreren Lanes zu sequenzieren. Single-Lane Sequencing ist für die 25B Flow Cell verfügbar. Dies verschafft Ihnen mehr Flexibilität für Ihr Projekt und ermöglicht eine kosteneffiziente Sequenzierung auch bei kleineren Probenzahlen.