Der erste Schritt im Next-Generation-Sequencing (NGS)-Arbeitsablauf ist die Erstellung der Sequenzier-Librarys. Isolierte DNA und RNA können nicht direkt auf der Flow Cell gebunden werden. Daher müssen die Nukleinsäuren entsprechend dem verwendeten Sequenziersystem vorbereitet werden. Dieser Prozess ist für eine erfolgreiche Sequenzierung notwendig. In diesem Artikel wollen wir einen Überblick über die notwendigen Schritte geben.
Sequenzier-Librarys sind DNA-Fragmente, die sequenziert werden können. Um diese DNA-Fragmente zu erhalten, muss die Ausgangsprobe mehrere Schritte durchlaufen. Vereinfacht gesagt müssen verschiedene Komponenten an die Nukleinsäuren hinzugefügt werden, um unter anderem die Bindung an die Flow Cell zu gewährleisten, die Sequenzierung zu ermöglichen und die dabei entstehenden Reads den einzelnen Proben eindeutig zuordnen zu können. Die beiden meist genutzten Verfahren zur Herstellung von Sequenzier-Librarys sind der Ligation-basierte Ansatz und der Tagmentierungs-basierte Ansatz. Beide Verfahren werden im Folgenden genauer beleuchtet.
Bei beiden Verfahren ist doppelsträngige DNA das Ausgangmaterial. Wenn RNA analysiert werden soll, muss diese zunächst in cDNA umgeschrieben werden, bevor man mit der Erstellung der Library beginnen kann. Betrachten wir nun Abbildung 1A. Hier ist das Ligations-basierte Verfahren dargestellt. Im ersten Schritt erfolgt die Fragmentierung der Ausgangsprobe, welche entweder physikalisch oder enzymatisch erfolgen kann. Dabei entstehen DNA-Fragmente mit Überhängen. Diese Überhänge werden im nächsten Schritt enzymatisch bereinigt und mit einer Adeninbase versehen, wodurch ein A-Ende am DNA-Fragmente entsteht. An dieses A-Ende kann dann ein Adapter binden, der einen komplementären Thymin (T)-Überhang an seinem Ende besitzt. Diese Adapter sind wichtig, da sie die Bindung der Sequenzier-Library an die Flow Cell ermöglichen. Zudem enthalten sie einzelne Indexsequenzen, so-genannte Barcodes, die eine Probe individuell markieren. Jedes DNA-Fragment hat zwei Adapter: einen an jedem Ende. Die dazwischen liegende DNA ist die Ausgangsprobe und wird als Insert bezeichnet. Je nach Protokoll wird die fertige Library dann noch mittels PCR amplifiziert.
Vergleichen wir nun den Ablauf des Tagmentierungs-basierten Verfahrens, welcher in Abbildung 1B zu sehen ist. Auch hier wird mit der Fragmentierung eines doppelsträngigen DNA-Moleküls in kleinere Stücke begonnen. Anders als bei der Ligations-basierten Methode geschieht dies jedoch gleichzeitig mit der Bindung des Adapters. Die DNA wird dazu mit Transposase-Enzymen gemischt, die die Adapter in ihrer Struktur tragen. Die Transposasen schneiden die DNA und fügen gleichzeitig die Adapter an. Dies geschieht in einem einzigen Reaktionsschritt. Das Ergebnis sind Probenfragmente mit Adaptern auf jeder Seite. Auch hier wird, je nach Protokoll, ein anschließender PCR-Schritt durchgeführt. Im Vergleich zur Ligations-basierten Library-Vorbereitung ist dieser Ansatz aufgrund des kombinierten Schritts von Fragmentierung und Adapterbindung zeitsparender.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Library-Erstellung die Ausgangsproben für die Sequenzierung vorbereitet werden. Dies ist ein wichtiger Schritt, denn er entscheidet darüber, ob die Proben mit der Sequenzierplattform kompatibel sind und entsprechend sequenziert werden können. Außerdem werden die Proben dabei mittels Indexsequenzen individuell markiert. Dies wiederum ist die Grundlage, um einen Pool von Proben erstellen zu können. Die beiden hier vorgestellten Vorgehensweisen der Erstellung von Librarys sind in verschiedenen Kits erhältlich und gehören zu unserem Tagesgeschäft. Lassen Sie uns auch Ihre Proben für die Sequenzierung vorbereiten!
Abbildung 1 | Vergleich der Hauptschritte in der Vorbereitung von Librarys. A) Ligations-basierte Erstellung der Library; B) Tagmentierungs-basierte Erstellung der Library.