Der erste Schritt im Next-Generation-Sequencing (NGS)-Arbeitsablauf ist die Erstellung der Sequenzier-Librarys. Isolierte DNA und RNA kรถnnen nicht direkt auf der Flow Cell gebunden werden. Daher mรผssen die Nukleinsรคuren entsprechend dem verwendeten Sequenziersystem vorbereitet werden. Dieser Prozess ist fรผr eine erfolgreiche Sequenzierung notwendig. In diesem Artikel wollen wir einen รberblick รผber die notwendigen Schritte geben.
Sequenzier-Librarys sind DNA-Fragmente, die sequenziert werden kรถnnen. Um diese DNA-Fragmente zu erhalten, muss die Ausgangsprobe mehrere Schritte durchlaufen. Vereinfacht gesagt mรผssen verschiedene Komponenten an die Nukleinsรคuren hinzugefรผgt werden, um unter anderem die Bindung an die Flow Cell zu gewรคhrleisten, die Sequenzierung zu ermรถglichen und die dabei entstehenden Reads den einzelnen Proben eindeutig zuordnen zu kรถnnen. Die beiden meist genutzten Verfahren zur Herstellung von Sequenzier-Librarys sind der Ligation-basierte Ansatz und der Tagmentierungs-basierte Ansatz. Beide Verfahren werden im Folgenden genauer beleuchtet.
Bei beiden Verfahren ist doppelstrรคngige DNA das Ausgangmaterial. Wenn RNA analysiert werden soll, muss diese zunรคchst in cDNA umgeschrieben werden, bevor man mit der Erstellung der Library beginnen kann. Betrachten wir nun Abbildung 1A. Hier ist das Ligations-basierte Verfahren dargestellt. Im ersten Schritt erfolgt die Fragmentierung der Ausgangsprobe, welche entweder physikalisch oder enzymatisch erfolgen kann. Dabei entstehen DNA-Fragmente mit รberhรคngen. Diese รberhรคnge werden im nรคchsten Schritt enzymatisch bereinigt und mit einer Adeninbase versehen, wodurch ein A-Ende am DNA-Fragmente entsteht. An dieses A-Ende kann dann ein Adapter binden, der einen komplementรคren Thymin (T)-รberhang an seinem Ende besitzt. Diese Adapter sind wichtig, da sie die Bindung der Sequenzier-Library an die Flow Cell ermรถglichen. Zudem enthalten sie einzelne Indexsequenzen, so-genannte Barcodes, die eine Probe individuell markieren. Jedes DNA-Fragment hat zwei Adapter: einen an jedem Ende. Die dazwischen liegende DNA ist die Ausgangsprobe und wird als Insert bezeichnet. Je nach Protokoll wird die fertige Library dann noch mittels PCR amplifiziert.
Vergleichen wir nun den Ablauf des Tagmentierungs-basierten Verfahrens, welcher in Abbildung 1B zu sehen ist. Auch hier wird mit der Fragmentierung eines doppelstrรคngigen DNA-Molekรผls in kleinere Stรผcke begonnen. Anders als bei der Ligations-basierten Methode geschieht dies jedoch gleichzeitig mit der Bindung des Adapters. Die DNA wird dazu mit Transposase-Enzymen gemischt, die die Adapter in ihrer Struktur tragen. Die Transposasen schneiden die DNA und fรผgen gleichzeitig die Adapter an. Dies geschieht in einem einzigen Reaktionsschritt. Das Ergebnis sind Probenfragmente mit Adaptern auf jeder Seite. Auch hier wird, je nach Protokoll, ein anschlieรender PCR-Schritt durchgefรผhrt. Im Vergleich zur Ligations-basierten Library-Vorbereitung ist dieser Ansatz aufgrund des kombinierten Schritts von Fragmentierung und Adapterbindung zeitsparender.
Zusammenfassend lรคsst sich sagen, dass durch die Library-Erstellung die Ausgangsproben fรผr die Sequenzierung vorbereitet werden. Dies ist ein wichtiger Schritt, denn er entscheidet darรผber, ob die Proben mit der Sequenzierplattform kompatibel sind und entsprechend sequenziert werden kรถnnen. Auรerdem werden die Proben dabei mittels Indexsequenzen individuell markiert. Dies wiederum ist die Grundlage, um einen Pool von Proben erstellen zu kรถnnen. Die beiden hier vorgestellten Vorgehensweisen der Erstellung von Librarys sind in verschiedenen Kits erhรคltlich und gehรถren zu unserem Tagesgeschรคft. Lassen Sie uns auch Ihre Proben fรผr die Sequenzierung vorbereiten!
Abbildung 1 | Vergleich der Hauptschritte in der Vorbereitung von Librarys. A) Ligations-basierte Erstellung der Library; B)ย Tagmentierungs-basierte Erstellung der Library.