Mit der Multiplexing-Strategie können hunderte von Proben in einem einzigen Sequenzierlauf sequenziert werden. Für die gebündelte (“multiplexed”) Sequenzierung werden während der Vorbereitung der Library individuelle Barcode-Sequenzen, an jedes DNA-Fragment hinzugefügt. Diese werden auch Index Adapter genannt. Die Libraries werden dann zu einem Pool zusammengefasst und auf unseren Hochdurchsatz-Sequenzierplattformen sequenziert. Nach der Sequenzierung kann die Herkunft jedes Reads aufgrund seiner Index Adapter bestimmt und der entsprechenden Probe zugeordnet werden, bevor die Daten analysiert werden. Dieser Prozess wird Demultiplexing genannt. Der beschriebene Ablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Nachdem jeder Read entsprechend seinem Probenursprung zugeordnet wurde, werden die Index Adapter entfernt („trimming“) und die Anzahl der unbearbeiteten Reads („number of raw reads“) pro Probe wird bestimmt.
Während des Mapping-Prozesses werden die Reads einer Referenz zugeordnet. Reads, die nirgends auf der Referenz zugeordnet werden können, werden als nicht-zugeordnete Reads („unmapped reads“) gezählt. Es gibt zahlreiche Gründe dafür, warum die Anzahl der nicht-zugeordneten Reads hoch sein kann:
- Abweichung der Spezies: Besonders bei der Arbeit mit bakteriellen Proben kann sich die Bakterienart evolutionär von der Referenzart auseinanderentwickelt haben. Es ist entscheidend, die richtige Unterart oder den richtigen Stamm als Referenzgenom zu verwenden, um eine hohe Anzahl an nicht-zugeordneten Reads zu vermeiden. Daher sollte das Referenzgenom der sequenzierten Art so ähnlich wie möglich sein.
- Unvollständiges Referenzgenom: Wenn das Referenzgenom unvollständig ist, dann können die Reads, die eigentlich dem fehlenden Teil in der Referenz zugeordnet werden würden, nicht zugeordnet werden. Das kann besonders für die Referenzen der Fall sein, die nur als so-genannte „contig“ oder „scaffold“-Level verfügbar sind. Daher verwenden wir für unsere Analysen nur Referenzen, die mit den Leveln „Chromosom“ oder „vollständige Genomrepräsentation“ verfügbar sind.
- Probenkontamination: Wenn eine Probe mit einem anderen Organismus kontaminiert ist, dann können die Reads des Kontaminanten nicht der Proben-Referenz zugeordnet werden und verbleiben als nichtzugeordnete.
- Bakteriophagen: Bakteriophagen oder Prophagen können in Proben vorkommen. Wenn die Genomsequenz der Bakteriophage nicht in der Referenz enthalten ist, dann können diese Reads nicht zugeordnet werden und verbleiben als nicht-zugeordnete Reads.
- Plasmide: Wie Bakteriophagen können exogene Plasmide in bakteriellen Proben vorkommen. Diese Plasmide kommen aber nicht notwendigerweise in der Referenz vor. Daher verbleiben die Reads der Plasmide als nicht-zugeordnete Reads.
- Reads mit niedriger Qualität: Wenn die Qualität eines Reads zu niedrig ist, dann kann der Mapping-Algorithmus den Read möglicherweise keiner Stelle in der Referenz zuordnen und dieser verbleiben als nicht-zugeordneter Read.
- Unpassende Alignment-Parameter: Wenn die Parameter für den Algorithmus, der die Reads der Referenz zuordnet, nicht korrekt gewählt werden, dann können Reads, die normalerweise der Referenz zugeordnet werden könnten, nicht mehr adäquat zugeordnet werden und verbleiben als nicht-zugeordnete Reads.
Die Anzahl der nicht-zugeordneten Reads hängt mit der Anzahl der zugeordneten Reads zusammen: Wenn die Anzahl der nicht-zugeordneten Reads hoch ist, dann ist die Anzahl der zugeordneten Reads niedrig und andersherum. Die zugeordneten Reads („mapped reads“) beziehen sich auf die Reads, die einer Region im Referenzgenom zugeordnet werden können. Innerhalb der zugeordneten Reads wird zwischen duplizierten und einmaligen Reads unterschieden.
Duplizierte Reads („duplicate reads“) werden identifiziert und während des Mapping-Prozesses entfernt. Diese duplizierten Reads bestehen aus mehrere sequenzierte Reads, die exakt derselben Stelle in der Referenz zugeordnet werden können. Die duplizierten Reads stammen vom gleichen Start-Fragment, welches amplifiziert wurde. Daher liefern duplizierte Reads keinen zusätzlichen Informationsgehalt und sollten vor der bioinformatischen Analyse entfernt werden. Versäumt man, die duplizierten Reads zu entfernen, kann dies dazu führen, dass die Abdeckung bestimmter Regionen künstlich erhöht wird. Das kann wiederum dazu führen, dass SNPs möglicherweise überrepräsentiert sind oder falsche Varianten vorhergesagt werden. Die Duplikationsrate ist definiert als Bruchzahl der duplizierten Reads im Zähler und den einmaligen Reads im Nenner. Hohe Duplikationsraten können hervorgerufen werden durch:
- geringe Probenqualität,
- Reagenzien von Vorbereitungs-Kits für Librarys mit wenig Ausgangsmaterial,
- die Verwendung von Librarys mit geringer Komplexität bei der Hybrid-Erfassung,
- PCR-Überamplifizierung während oder nach der Vorbereitung der Library oder
- über-Sequenzierung.
Daher sollte auf eine adäquate Menge und Qualität des Ausgansmaterials geachtet werden, um die Duplikationsrate zu minimieren. Zusätzlich sollte die Anzahl der PCR-Zyklen, wenn möglich, reduziert werden. Darüber hinaus kann der Einsatz der Paired-End-Sequenzierung von Nutzen sein.
Die einmalig zugeordneten Reads verbleiben, nachdem die nicht zugeordneten und die als Duplikate markierte Reads abgezogen wurden. Diese Reads können einer Position innerhalb des Referenzgenoms zugeordnet werden. Da diese Reads einzigartig sind, können sie das Vertrauen in die Abdeckung der Zielregion und daher auch in die Bestimmung von Varianten erhöhen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anzahl der unbearbeiteten Reads die Summe aller nicht-zugeordneten Reads und aller zugeordneten Reads ist. Die zugeordneten Reads lassen sich in duplizierte und einmalige Reads unterteilen.
Abbildung 1 | Ablauf der Sequenzierung. Mit der Multiplexing-Strategie können zahlreiche Proben mit einem Sequenzierlauf gleichzeitig sequenziert werden. Hierfür werden Barcode-Sequenzen mit einem Index Adapter an die Fragmente angefügt und diese anschließend für die Sequenzierung in einem Pool zusammengefasst. Nach der Sequenzierung findet das Demultiplexing statt. In diesem Prozess werden die Reads aufgrund ihrer Index Adapter (gelb und hellblau) zurück zu ihrem Probenursprung (rot und blau) sortiert. Die Anzahl der unbearbeiteten Reads wird dann für jede Probe bestimmt. Anschließend werden die Reads der Referenz zugeordnet. Reads, die aus zahlreichen Gründen nicht der Referenz zugeordnet werden können, werden als nicht-zugeordnete Reads („unmapped reads“) bezeichnet (dunkelrot). Die Reads, die der Referenz zugeordnet werden können, werden weiter unterschieden in duplizierte Reads (hellrot) und einmalig zugeordnete Reads (rot).