Planen Sie eine Mikrobiom-Studie? Falls ja, dann haben Sie vielleicht schon darüber nachgedacht, ob sie lieber die 16S-rRNA-Sequenzierung oder die Shotgun-Sequenzierung verwenden sollten. In diesem Artikel möchten wir die Unterschiede der beiden Methoden, sowie ihre Stärken und Schwächen, aufzeigen.
Mikroorganismen sind die am häufigsten vorkommende Lebensform. Sie bevölkern zahlreiche metabolische Nischen – von der Tiefsee bis zur entlegensten Wüste. Die 16S-rRNA-Sequenzierung ist eine gängige Methode zur Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften. Allerdings rückt auch die metagenomische Shotgun-Sequenzierung immer mehr in den Fokus. Um zu entscheiden, welche Methode zu Ihrem Projekt passt, sollten die Stärken und Schwächen der beiden Ansätze mit einbezogen werden.
Wir möchten zuerst die 16S-rRNA-Sequenzierung genauer beleuchten. Bei dieser Sequenzierung stehen die hypervariablen Regionen (V1-V9) des 16S-rRNA-Gens im Fokus. Die meisten herkömmlichen 16S-Sequenzierungsansätze decken aber nicht alle hypervariablen Regionen ab. Die 16S-Sequenzierung in voller Länge („full-length 16S sequencing“) ermöglicht hingegen die Analyse des gesamten 16S-Gens mit allen hypervariablen Regionen. Die Amplifizierung erfolgt mittels PCR. Danach wird die Library vorbereitet und die Probe sequenziert. Nach der Sequenzierung können die Daten mit Hilfe von gängigen Referenzdatenbanken analysiert werden. Die 16S-Sequenzierung gibt Einblick in die Zusammensetzung der Probe. Organismen können bis auf Genus oder sogar Spezies-Ebene identifiziert werden. Allerdings kommt das 16S-Gen nur in Bakterien und Archaeen vor, wodurch diese Methode nur für diese mikrobiellen Domänen angewendet werden kann. Zusätzlich ist die 16S-Sequenzierung in voller Länge bei uns aufgrund der PCR-Primer auf Bakterien beschränkt.
Im Vergleich zu diesem gezielten Ansatz bekommt die Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung ihren Namen daher, dass sie die gesamte DNA einer mikrobiellen Probe willkürlich in viele kleine Fragmente bricht. Die Fragmentierung wird durch mechanische Scherung erreicht. Nach dem Fragmentierungs-Schritt werden die Sequenzier-Librarys vorbereitet. Datenbanken sind verfügbar, um die Sequenzierergebnisse zu analysieren. Für die meisten Ökosysteme sind diese Datenbanken aber leider nicht vollständig. Um aber unbekannte und nicht-kultivierbare Mikroorganismen zu identifizieren, kann ein de-novo Assembly durchgeführt werden. Zusätzlich ermöglicht die Analyse der gesamten Mikroben-Genome Einblicke in die funktionellen Eigenschaften der individuellen Mikroben. Die Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung ist hierbei nicht auf die mikrobiellen Domänen in der Probe beschränkt, sondern erlaubt die gleichzeitige Detektion von Bakterien, Pilzen, Viren und zahlreichen anderen Mikroorganismen. Abbildung 1 stellt die Ansätze der zwei beschriebenen Methoden gegenüber.
Als nächstes wollen wir die Stärken und Schwächen der beiden Methoden genauer beleuchten. Dabei werden wir die möglichen Probentypen, die Zusammensetzung der Probe und ihre Funktionen, die möglichen Analysen und die Datenkapazität betrachten: Komplexere Proben profitieren von der Shotgun-Sequenzierung. Für weniger komplexe Proben mit bekannten Bakterien und einem generellen Interesse für die genaue Zusammensetzung und das Verhältnis der Arten, ist die 16S-Sequenzierung eine gute Option. Zusätzlich muss klar sein, wie exakt die Zusammensetzung bestimmt werden soll. Reicht eine Bestimmung auf Genus-Ebene, sollte sie bis auf die Spezies-Ebene genau sein oder sogar bis auf Stamm-Ebene? Soll zusätzlich zur Zusammensetzung auch die Funktion der einzelnen Organismen untersucht werden? Der Informationsgehalt ist bei der Shotgun-Sequenzierung höher als bei der 16S-Sequenzierung. Zusätzlich muss aber in Betracht gezogen werden, dass die Bearbeitung und Interpretation von Shotgun-Sequenzierungen mehr Datenkapazität und Erfahrung erfordern.
Mit diesen Informationen sind Sie nun bereit für Ihr nächstes Metagenom-Projekt. CeGaT bietet sowohl Full-Length 16S Sequencing als auch Shotgun Metagenomic Sequencing an. Zögern Sie nicht, die Diversität Ihrer Probe zu entschlüsseln!
Abbildung 1 | Vergleich des 16S-Sequenziersansatzes und des Shotgun-Sequenzieransatzes. Bei der 16S-Sequenzierung können nur Bakterien untersucht werden. Bei der Shotgun-Sequenzierung hingegen können zahlreiche unterschiedliche Mikroorganismen untersucht werden.