Die Einzelzellsequenzierung („single-cell sequencing“) ermöglicht die Analyse einer Probe in Einzelzellauflösung. Hierfür wurden für viele Anwendungen unterschiedliche Protokolle etabliert. Wir wollen zeigen, wie sich diese Unterschiede in den Arbeitsschritten widerspiegeln und was dies für die Auswahl des richtigen Produktes bedeutet.
CeGaT bietet derzeit drei Produkte zur Einzelzellsequenzierung an: 3‘ Single-Cell Sequencing (3‘ SCR), Single-Cell Immune Profiling (SIP) und Single-Cell RNA Sequencing Flex (SCR Flex). Alle Produkte basieren auf 10x Genomics®-Protokollen und werden auf dem Chromium™ X durchgeführt. Für alle Produkte gilt, dass bei der Probenvorbereitung Gel-Beads in Emulsionen, kurz GEMs, auf einem Chromium-Chip erzeugt werden. Dabei erhalten die Zellen einen Barcode mit einem eindeutigen molekularen Identifikator („unique molecular identifier“, UMI). Worin bestehen also die Unterschiede? Schauen wir uns die Protokolle einmal genauer an (siehe Abbildung 1).
Als Erstes unterscheidet sich das Probenmaterial, das verwendet werden kann. Für SCR Flex werden fixierte Zellen oder FFPE-Röllchen verwendet. Im Gegensatz dazu werden für 3‘ SCR und SIP einzelne Zellen in gefrorener Suspension benötigt. Zweitens unterscheiden sich die Protokolle in der Art und Weise, wie die Librarys generiert werden. Bei SCR Flex erfolgt dies mit spezifischen Sonden, die an die Proben hybridisiert werden, bevor die GEMs erstellt werden. In den folgenden Schritten erfolgt die Ligation basierend auf der RNA-Vorlage. Die resultierenden Librarys repräsentieren die Protein-kodierenden Gene der Zellen aus der Probe. Im Vergleich dazu basiert die Library-Erstellung für 3‘ SCR und SIP auf reverser Transkription. Diese Transkription startet entweder am 3‘-Ende oder am 5‘-Ende, wobei Poly-(dT)-Primer für die Amplifikation der Zielregion verwendet werden. Somit repräsentieren die finalen Librarys entweder das 3′-Ende des mRNA-Transkripts für 3‘ SCR oder das 5′-Ende der mRNA für SIP. Für SIP werden zusätzlich noch die V(D)J-Segmente amplifiziert. Alle Librarys können auf Illumina-Plattformen sequenziert werden. Nach der Sequenzierung können die jeweiligen Expressionsprofile der einzelnen Zellen in der Probe ausgewertet werden.
Um das geeignete Single-Cell RNA Sequencing-Produkt für Ihr Projekt zu finden, ist es wichtig, den vorliegenden Probentyp sowie das Forschungsziel zu berücksichtigen. Single-Cell Immune Profiling erfordert als Ausgangsmaterial eine gefrorene Einzelzellsuspension. Single-Cell RNA Sequencing Flex ermöglicht es, die Zellen für die spätere Analyse zu fixieren, was bei 3‘ Single-Cell RNA Sequencing nicht möglich ist. 3′ Single-Cell RNA Sequencing und Single-Cell RNA Sequencing Flex unterscheiden sich zusätzlich in der Libray-Erstellung und vor allem der Zielregion. Lassen Sie uns gemeinsam das richtige Single-Cell-RNA-Sequencing-Produkt für Ihr Projekt finden. Wir beraten Sie gerne!
Abbildung 1 | Übersicht über die verschiedenen Single-Cell-RNA-Sequencing Produkte. Die Unterschiede zwischen den Produkten sind dargestellt.