Jeder, der bereits mit RNA gearbeitet hat, weiß, wie herausfordernd RNA sein kann und dass es im Vergleich zur Arbeit mit DNA viel zu beachten gibt. Aber warum ist die Arbeit mit RNA so herausfordernd? Wie kann man trotzdem die bestmögliche Qualität der RNA-Probe erhalten? Wir möchten die wichtigsten Aspekte bei der Arbeit mit RNA in diesem Artikel zusammenfassen.
Zuerst sollte man sich bewusst machen, dass RNA, im Gegensatz zur DNA, nicht dafür gemacht ist, für lange Zeit stabil zu sein. Das wird besonders deutlich, wenn man die Funktion des RNA-Moleküls betrachtet: Die RNA ist für den Informationstransfer und die Informationskontrolle gedacht, nicht aber für die Informationsspeicherung, was die Aufgabe der DNA ist. Die RNA ist einzelsträngig und enthält Ribose-Zucker anstelle der Deoxyribose-Zucker der doppelsträngigen DNA. Diese beiden strukturellen Unterschiede machen die RNA instabil und anfälliger für Degradierung. Am herausforderndsten bei der Arbeit mit RNA-Proben sind aber vermutlich die RNA-degradierenden Enzyme, die auch Ribonukleasen (RNasen) genannt werden. Sie kommen fast überall vor. Im menschlichen Körper zum Beispiel kommen RNasen als Schutzmechanismus gegen invasive Mikroorganismen zum Einsatz. Daher sind diese Enzyme in Körperflüssigkeiten wie Tränen, Speichel, Schleim oder Schweiß vorhanden. RNAsen können aber zum Beispiel auch auf schuppiger Haut oder Haaren vorkommen. Zusätzlich sind RNasen sehr stabile und resistente Enzyme. Einige überstehen sogar Temperaturen von + 100°C.
Daher gibt es einige Punkte zu beachten, um qualitativ hochwertige RNA-Proben zu erhalten. In erster Linie müssen alle möglichen Maßnahmen ergriffen werden, um eine Kontamination des Arbeitsplatzes mit RNasen während der RNA-Isolation und der weiteren Handhabung zu verhindern. Vor dem Start der RNA-Isolation sollten daher alle Oberflächen der Labortische mit handelsüblichen RNase-inaktivierenden Mitteln behandelt werden. Zusätzlich sollten die Labortische mit 100 % Ethanol abgewischt werden, um sie von möglichen Mikroorganismen zu befreien. Alle Glaswaren und Gebrauchsgegenstände aus Plastik, die während der Isolation verwendet werden, müssen RNase frei und steril sein. Glasbehälter müssen ordnungsgemäß mit Hitze behandelt werden. Es ist notwendig, die ganze Zeit saubere Handschuhe und einen Labormantel zu tragen. Gegenstände, die nicht mit RNase-Inhibitoren behandelt wurden, sollten nicht berührt werden. Zusätzlich sollten selbst behandelte Gegenstände so wenig wie möglich berührt werden. Das Berühren der Haut sollte grundsätzlich vermieden werden. Zusätzlich sollten die Handschuhe regelmäßig gewechselt werden. Generell ist eine sehr gute, sterile Technik notwendig. Röhrchen und Flaschen sollten wann immer möglich geschlossen sein und Husten, Niesen oder Atmen über offenen Behältnissen sollte vermieden werden. RNA-Proben sollten immer auf Eis gelagert und bei jedem Arbeitsschritt behutsam pipettiert werden.
Nach der erfolgreichen RNA-Isolation, muss diese sicher gelagert werden. Durch ihre allgemeine Anfälligkeit für Degradierung sollte RNA immer bei – 80°C gelagert werden. Selbst kleinste Spuren von RNasen können die Unversehrtheit der RNA bedrohen. Die RNA kann in reinem Wasser, 10 mM Tris-HCl pH 8 oder einem EDTA-freien Elutionspuffer gelagert werden. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Gegenstände, die für die Arbeit mit RNA notwendig sind. Halten Sie diese bereit, wenn Sie Ihr RNA-Projekt starten.
Am Ende sind Ihre Proben vorbereitet und sicher gelagert. Sie können nun für die Sequenzierung zu uns geschickt werden. Die Proben sollten nur auf Trockeneis versendet werden, um ein Auftauen zu vermeiden. Sobald Ihre Proben bei uns ankommen, werden wir uns um sie kümmern und bei jedem Schritt dafür sorgen, dass Kontamination und Degradierung vermieden werden.
Abbildung 1 | Die wichtigsten Gegenstände bei der Arbeit mit RNA.